サイトカイン、神経可塑性修飾因子、および脊柱管狭窄症と内視鏡的除圧術におけるバイオマーカー

脊柱管狭窄症は、患者に痛みや障害を引き起こす一般的な筋骨格系疾患です。 しかし、この疾患の病因は複雑であり、まだ完全には解明されていません。 腰部脊柱管狭窄症は、脊柱管の後方に位置する構造物の変性変化、すなわち黄色靭帯（LF）の肥厚、靭帯石灰化、椎間関節の変性・肥厚、および／または脊柱管前方に位置する椎間板ヘルニアに起因します。 黄色靭帯肥厚の病態には、II型コラーゲン増殖に伴う線維軟骨性変化、骨化、カルシウム結晶沈着、コラーゲンおよび弾性線維の変性、ならびに靭帯線維芽細胞の軟骨様化生が含まれます。 多くの科学的研究が、全身性、局所性、遺伝的、環境的要因を考慮し、脊柱靭帯の肥厚と骨化の病因を探求しようと試みてきました。 しかし、変性発症のメカニズムは依然として完全には理解されていません。 靭帯における機械的ストレスとコラーゲン合成の増加（線維症）に加えて、加齢が主要な危険因子であることに加え、炎症とマクロファージ浸潤の存在が変性発症に重要な寄与因子であると考えられています。

したがって、他の健康状態、特に慢性疾患に伴う炎症の存在が、未知の程度で脊柱構造物の変性経過に影響を与える可能性があると仮定するのは合理的です。 現在、肥満とサルコペニアは、人体の全てのシステムに影響を与える疾患として特に注目を集めています。 その有病率が増加しているため、個々の臓器への影響を徹底的に理解することは、予防と健康保護において社会的・実践的に重要な意義を持ちます。

増加する報告によれば、脂質代謝の障害および炎症促進性アディポカインとサイトカインの分泌が、変性性脊椎・関節疾患の病態生理学的プロセスにおける細胞表現型と運命、細胞外マトリックス代謝、炎症の調節に深く関与しています。 代謝異常は骨代謝に影響を及ぼし、脊柱靭帯だけでなく他の脊柱構造物においても異所性骨化と脂肪沈着を引き起こす可能性があります。 また、筋骨格系変性疾患の発症に対するアディポキノームの影響も注目に値します。 脊柱管内に解剖学的に存在する硬膜外脂肪でさえ、炎症を起こし、自発的に炎症性サイトカインを分泌し、傍脊柱筋や靭帯などの隣接組織の機能を変化させる可能性があります。 脊柱管狭窄症を引き起こす硬膜外腔における過剰な脂肪組織を特徴とする脊柱硬膜外脂肪腫症が、肥満と強く関連していることも言及する価値があります。

これまでに、アディポカインとその受容体は、主に白色脂肪組織に存在するものの、関節軟骨や脊柱骨髄にも存在することが確認されています。 アディポカインは、炎症反応を刺激し、病的変化を促進することにより、黄色靭帯変性を促進する可能性があります。 レプチンは、靭帯骨化の影響を受ける椎骨の数と有意に関連することが示されています。 Fanらは、レプチンが黄色靭帯細胞におけるアルカリホスファターゼとオステオカルシンのmRNA発現を著しく上方制御することを発見しました。 骨化が確認された患者の黄色靭帯では、高レベルのビスファチンも見つかっています。 アディプシン、バスピン、レジスチン、リポカリン-2、プログラヌリン、ケメリン、オメンティン-1、または成長分化因子-15（GDF-15）などの他の脂肪組織由来サイトカインの黄色靭帯における存在と役割に関する利用可能なデータはありません。 これらのサイトカインも脊柱管狭窄症の発症に関与している可能性が非常に高く、これが私たちの研究仮説を構成します。 狭窄症患者の硬膜外脂肪組織におけるこれらのサイトカインの存在とレベルは、脊柱管狭窄のない患者と比較して、これまで研究されていません。 慢性的な全身性炎症が様々な組織に影響を与え、局所炎症が隣接する構造物に著しく影響を与えることが研究で確認されているため、私たちは、靭帯、傍脊柱筋、椎間板などが、硬膜外脂肪組織によって分泌されるサイトカインに対して特に脆弱である可能性があると仮説を立てています。 以前のin vitro研究では、IL-6、IL-1α、一酸化窒素供与体（SNAP）、プロスタグランジンE2などのサイトカインが豊富な局所環境が、黄色靭帯細胞におけるI型、V型、XI型コラーゲンおよびオステオカルシンの遺伝子発現を変化させることを確認しました。 しかし、前述のアディポカインが黄色靭帯変性の発症に与える影響は、まだ決定されていません。

本研究では、脊柱管狭窄症および椎間板ヘルニアの患者から手術中に定期的に切除される組織におけるサイトカイン（特にアディポカイン）と神経可塑性調節因子の濃度およびそれらのmRNA発現を調べることに加えて、患者から術前および術後2ヶ月の経過観察時に2回血液を採取します。

目的

1. 狭窄症患者の腰部から採取した黄色靭帯、傍脊柱筋、硬膜外脂肪のサンプルにおいて、脊柱管変性のない患者と比較して選択されたバイオマーカー濃度の差異を特定する。
2. 組織における選択されたバイオマーカーの発現が、患者の血液中の存在と相関するかどうか、および変性度、障害度、疼痛強度、体重と関連するかどうかを決定する。
3. 手術前と回復期2ヶ月目のバイオマーカーレベルを比較することにより、脊柱管除圧術の効果をモニタリングするための潜在的なバイオマーカーを選択する。
4. 黄色靭帯における代謝と炎症を調節する潜在的なタンパク質を同定する。
5. 黄色靭帯細胞培養における代謝と炎症に対する選択されたサイトカインおよび硬膜外脂肪組織のアディポキノームの影響を評価する。

研究対象集団の説明

本研究には、ポズナン医科大学整形外科・リハビリテーション臨床病院の男女100名の患者が参加します：

• 腰部脊柱管狭窄症の患者50名、年齢40-90歳
• 椎間板ヘルニアの患者50名、年齢18-40歳、外科的治療を必要とする参加者は、科学研究に自分の組織を使用することに同意した場合に手術を受けます。
• 研究群は、内視鏡下脊柱管除圧術を受け、神経構造を圧迫している組織（骨、靭帯、関節）を除去し、場合によっては転位した椎間板断片を除去します。
• 対照群は、孤立性椎間板ヘルニア手術を受け、転位した椎間板断片を除去します。

方法 手術前（48時間以内）および術後2ヶ月に、各患者から20mlの静脈血を採取します。

手術中に以下のサンプルを収集します：

• 傍脊柱筋組織
• 黄色靭帯
• 硬膜外脂肪組織

研究では以下の方法／ツールを使用します：

1. 障害度と疼痛強度の標準化質問票
2. 腰椎MRI（手術前に定期的に実施）

3. 分子検査

   1. サイトカイン（GDF-15、アディプシン、バスピン、レジスチン、リポカリン-2、プログラヌリン、ケメリン、オメンティン-1）のmRNA発現をPCRを用いて測定します。
   2. 組織ホモジネートおよび血清において、市販のELISAキットを用いた免疫測定法を実施し、タンパク質濃度（GDF-15、アディプシン、バスピン、レジスチン、リポカリン-2、プログラヌリン、ケメリン、オメンティン-1）を決定します。
4. 細胞培養およびサイトカインと脂肪組織から得られた培地による細胞刺激 生物学的材料の3分の1を細胞培養研究に割り当てます。 黄色靭帯、傍脊柱筋、硬膜外脂肪組織のサンプルは、手術直後に収集し、適切な輸送培地を入れた無菌容器に置きます。

全てのサンプルは、収集後できるだけ短時間で、無菌状態の下、直ちに細胞培養実験室に搬送されます。 実験室到着後、各組織タイプの特性に合わせて調整された、事前に確立された適切な細胞単離プロトコルを受けます。

暴露期間後、筋細胞および黄色靭帯線維芽細胞の培養から収集した条件付き培地において、サイトカイン、線維症マーカー、骨マーカー、細胞外マトリックスタンパク質、マトリックス分解酵素のmRNA発現およびタンパク質レベルを測定します。