Цитокины, модуляторы нейропластичности и биомаркеры при стенозе позвоночного канала и эндоскопической декомпрессии

Спинальный стеноз — это распространённое заболевание опорно-двигательного аппарата, вызывающее боль или инвалидность у пациентов. Однако патогенез этого заболевания сложен и до сих пор не полностью изучен. Стеноз поясничного позвоночного канала возникает в результате дегенеративных изменений структур, расположенных позади спинного мозга, таких как гипертрофия жёлтой связки (ЖС), а также кальцификация связок, дегенерация и гипертрофия фасеточных суставов и/или грыжа межпозвонковых дисков, расположенных кпереди от спинного мозга. Патология гипертрофии ЖС включает фиброзно-хрящевые изменения, связанные с пролиферацией коллагена II типа, оссификацию, отложение кальциевых кристаллов, дегенерацию коллагеновых и эластических волокон и хондроидную метаплазию фибробластов связки. Многочисленные научные исследования пытались изучить этиологию гипертрофии и оссификации спинальных связок, учитывая системные, локальные, генетические и факторы окружающей среды. Однако механизм развития дегенерации до сих пор не полностью понят. Помимо механического стресса и усиленного синтеза коллагена (фиброза) в связке, что делает возраст основным фактором риска, наличие воспаления и инфильтрации макрофагов считается важным фактором, способствующим развитию дегенерации.

Поэтому разумно предположить, что наличие воспаления, связанного с другими заболеваниями — особенно хроническими — может в неизвестной степени влиять на течение дегенерации структур позвоночника. В настоящее время особое внимание привлекают ожирение и саркопения как нарушения, затрагивающие все системы организма человека. Поскольку их распространённость растёт, тщательное понимание их последствий для отдельных органов имеет большое социальное и практическое значение для профилактики и охраны здоровья.

Всё больше сообщений указывают, что нарушения липидного обмена и секреция провоспалительных адипокинов и цитокинов глубоко вовлечены в регуляцию клеточных фенотипов и судеб, метаболизма внеклеточного матрикса и воспаления в патофизиологических процессах дегенеративных заболеваний позвоночника и суставов. Метаболические нарушения могут влиять на метаболизм костной ткани и приводить к эктопической оссификации и отложению жира не только в спинальных связках, но и в других структурах позвоночника. Также стоит отметить влияние адипокинома на развитие дегенеративных нарушений опорно-двигательного аппарата. Даже анатомически присутствующая эпидуральная жировая ткань в позвоночном канале может воспаляться и спонтанно секретировать воспалительные цитокины, потенциально изменяя функцию соседних тканей, таких как паравертебральные мышцы и связки. Стоит упомянуть, что спинальный эпидуральный липоматоз, характеризующийся избытком жировой ткани в эпидуральном пространстве, приводящим к стенозу позвоночного канала, тесно связан с ожирением.

До сих пор подтверждено, что адипокины и их рецепторы, хотя в основном расположены в белой жировой ткани, также присутствуют в суставном хряще и костном мозге позвоночника. Адипокины могут способствовать дегенерации жёлтой связки, стимулируя воспалительные реакции и способствуя патологическим изменениям. Было показано, что лептин значительно коррелирует с количеством позвонков, поражённых оссификацией связок. Фан и др. обнаружили, что лептин заметно повышает экспрессию мРНК щелочной фосфатазы и остеокальцина в клетках жёлтой связки. Высокие уровни висфатина также были обнаружены в жёлтых связках пациентов с подтверждённой оссификацией. Нет доступных данных о наличии и роли других цитокинов, происходящих из жировой ткани, таких как адипсин, васпин, резистин, липокалин-2, програнулин, хемерин, оментин-1 или фактор роста и дифференцировки-15 (GDF-15) в жёлтой связке. Весьма вероятно, что эти цитокины также вовлечены в развитие стеноза позвоночного канала, что составляет нашу исследовательскую гипотезу. Присутствие и уровни этих цитокинов в эпидуральной жировой ткани у пациентов со стенозом по сравнению с теми, у кого нет сужения позвоночного канала, до настоящего времени не изучались. Поскольку исследования подтверждают, что хроническое системное воспаление влияет на различные ткани, а локальное воспаление значительно влияет на соседние структуры, мы предполагаем, что связки, паравертебральные мышцы, межпозвонковые диски и т.д. могут быть особенно уязвимы к цитокинам, секретируемым эпидуральной жировой тканью. Предыдущие исследования in vitro подтвердили, что локальная среда, богатая цитокинами, такими как IL-6, IL-1α, донор оксида азота (SNAP) и простагландин E2, изменяет экспрессию генов коллагенов I, V, XI и остеокальцина в клетках жёлтой связки. Однако влияние упомянутых адипокинов на развитие дегенерации жёлтой связки ещё не определено.

Исследование будет включать изучение концентраций цитокинов (особенно адипокинов) и модуляторов нейропластичности, а также их экспрессии мРНК в тканях, рутинно удаляемых у пациентов со спинальным стенозом и грыжей диска во время операции, а также забор крови у пациентов дважды: до процедуры и во время контрольного визита через два месяца после процедуры.

Цели

1. Выявить различия в концентрациях выбранных биомаркеров в образцах жёлтой связки, паравертебральных мышц и эпидурального жира, собранных из поясничной области у пациентов со стенозом, по сравнению с теми, у кого нет дегенерации позвоночного канала.
2. Определить, коррелирует ли экспрессия выбранных биомаркеров в тканях с их присутствием в крови пациентов и связаны ли они со степенью дегенерации, инвалидности, интенсивностью боли и массой тела.
3. Выбрать потенциальные биомаркеры для мониторинга эффективности операции по декомпрессии позвоночного канала путём сравнения уровней биомаркеров до операции и через два месяца восстановления.
4. Выявить потенциальные белки, модулирующие метаболизм и воспаление в жёлтой связке.
5. Оценить влияние выбранных цитокинов и адипокинома эпидуральной жировой ткани на метаболизм и воспаление в культурах клеток жёлтой связки.

Описание исследуемой популяции

В исследовании примут участие 100 пациентов из Ортопедическо-реабилитационной клинической больницы Познанского университета медицинских наук, включая мужчин и женщин:

• 50 пациентов со стенозом поясничного позвоночного канала в возрасте 40-90 лет
• 50 пациентов с грыжей межпозвонкового диска в возрасте 18-40 лет, требующих хирургического лечения. Участники пройдут операцию при условии предоставления информированного согласия на использование их тканей в научных исследованиях.
• Исследуемая группа пройдёт эндоскопическую декомпрессию позвоночного канала, включающую удаление тканей (кость, связка, сустав), сдавливающих нервные структуры, и, возможно, удаление смещённого фрагмента межпозвонкового диска.
• Контрольная группа пройдёт изолированную операцию по поводу грыжи межпозвонкового диска, включающую удаление смещённого фрагмента диска.

Методы Перед операцией (в течение 48 часов) и через два месяца после операции у каждого пациента будет взято 20 мл венозной крови.

Во время операции будут собраны следующие образцы:

• Ткань паравертебральных мышц
• Жёлтая связка
• Эпидуральная жировая ткань

В исследовании будут использоваться следующие методы/инструменты:

1. Стандартизированные опросники для оценки инвалидности и интенсивности боли
2. МРТ поясничного отдела позвоночника (рутинно выполняется перед операцией)

3. Молекулярные исследования

   1. Экспрессия мРНК цитокинов (GDF-15, адипсин, васпин, резистин, липокалин-2, програнулин, хемерин, оментин-1) будет измеряться с помощью ПЦР.
   2. Иммуноанализы с использованием коммерческих наборов ELISA будут проведены на гомогенатах тканей и сыворотке для определения концентраций белков (GDF-15, адипсин, васпин, резистин, липокалин-2, програнулин, хемерин, оментин-1)
4. Культивирование клеток и стимуляция клеток цитокинами и средой, полученной из жировой ткани Одна треть биологического материала будет выделена для исследований на клеточных культурах. Образцы жёлтой связки, паравертебральных мышц и эпидуральной жировой ткани будут собраны непосредственно после операции и помещены в стерильные контейнеры с соответствующей транспортной средой.

Все образцы будут немедленно доставлены в лабораторию клеточных культур в стерильных условиях, в кратчайшие сроки после сбора. По прибытии в лабораторию они пройдут соответствующие, заранее установленные протоколы выделения клеток, адаптированные к характеристикам каждого типа ткани.

После периода экспозиции в кондиционированной среде, собранной из культур миоцитов и фибробластов жёлтой связки, будет измерена экспрессия мРНК и уровни белков цитокинов, маркеров фиброза, костных маркеров, белков внеклеточного матрикса, ферментов деградации матрикса.