Citocinas, Moduladores da Neuroplasticidade e Biomarcadores na Estenose do Canal Vertebral e Descompressão Endoscópica

A estenose espinal é uma perturbação musculoesquelética comum que causa dor ou incapacidade nos doentes. No entanto, a patogénese desta doença é complexa e ainda não foi totalmente elucidada. A estenose do canal lombar resulta de alterações degenerativas nas estruturas localizadas atrás da medula espinal, como a hipertrofia do ligamento amarelo (LA), bem como calcificação ligamentar, degeneração e hipertrofia das articulações facetárias e/ou hérnia discal localizada anteriormente à medula espinal. A patologia da hipertrofia do LA inclui alterações fibrocartilaginosas associadas à proliferação de colagénio tipo II, ossificação, deposição de cristais de cálcio, degeneração de fibras de colagénio e elásticas, e metaplasia condroide dos fibroblastos ligamentares. Numerosos estudos científicos tentaram explorar a etiologia da hipertrofia e ossificação dos ligamentos espinais, considerando fatores sistémicos, locais, genéticos e ambientais. No entanto, o mecanismo de desenvolvimento da degeneração ainda não é totalmente compreendido. Além do stress mecânico e do aumento da síntese de colagénio (fibrose) no ligamento, que tornam a idade um fator de risco principal, a presença de inflamação e infiltração de macrófagos é considerada um contribuinte significativo para o desenvolvimento da degeneração.

Portanto, é razoável assumir que a presença de inflamação associada a outras condições de saúde - especialmente crónicas - pode, numa extensão desconhecida, influenciar o curso da degeneração das estruturas espinais. Atualmente, a obesidade e a sarcopenia estão a atrair particular atenção como perturbações que afetam todos os sistemas do corpo humano. Como a sua prevalência está a aumentar, uma compreensão aprofundada das suas consequências nos órgãos individuais tem importância social e prática significativa para a prevenção e proteção da saúde.

Um número crescente de relatórios indica que perturbações no metabolismo lipídico e na secreção de adipocinas e citocinas pró-inflamatórias estão profundamente envolvidas na regulação dos fenótipos e destinos celulares, metabolismo da matriz extracelular e inflamação nos processos fisiopatológicos das doenças degenerativas da coluna e articulações. As perturbações metabólicas podem afetar o metabolismo ósseo e levar à ossificação ectópica e deposição de gordura não apenas nos ligamentos espinais, mas também noutras estruturas da coluna. Também é de notar a influência do adipocinoma no desenvolvimento de perturbações degenerativas musculoesqueléticas. Mesmo a gordura epidural anatomicamente presente no canal espinal pode inflamar e secretar espontaneamente citocinas inflamatórias, potencialmente modificando a função dos tecidos adjacentes, como músculos paraespinais e ligamentos. Vale a pena mencionar que a lipomatose epidural espinal, caracterizada por um excesso de tecido adiposo no espaço epidural que leva à estenose do canal espinal, está fortemente associada à obesidade.

Até agora, foi confirmado que as adipocinas e os seus recetores, embora localizados principalmente no tecido adiposo branco, também estão presentes na cartilagem articular e na medula óssea espinal. As adipocinas podem promover a degeneração do ligamento amarelo ao estimular respostas inflamatórias e promover alterações patológicas. Demonstrou-se que a leptina se correlaciona significativamente com o número de vértebras afetadas por ossificação ligamentar. Fan et al. descobriram que a leptina regula positivamente marcadamente a expressão de mRNA da fosfatase alcalina e osteocalcina em células do ligamento amarelo. Também foram encontrados níveis elevados de visfatina nos ligamentos amarelos de doentes com ossificação confirmada. Não existem dados disponíveis sobre a presença e papel de outras citocinas derivadas do tecido adiposo, como a adipsina, vaspina, resistina, lipocalina-2, progranulina, quemerina, omentina-1 ou fator de crescimento e diferenciação-15 (GDF-15) no ligamento amarelo. É altamente provável que estas citocinas também estejam envolvidas no desenvolvimento da estenose do canal espinal, o que constitui a nossa hipótese de investigação. A presença e níveis destas citocinas no tecido adiposo epidural em doentes com estenose, em comparação com aqueles sem estreitamento do canal espinal, não foram estudados até à data. Uma vez que os estudos confirmam que a inflamação sistémica crónica afeta vários tecidos e a inflamação local afeta significativamente estruturas vizinhas, hipotetizamos que ligamentos, músculos paraespinais, discos intervertebrais, etc., podem ser particularmente vulneráveis a citocinas secretadas pelo tecido adiposo epidural. Estudos anteriores in vitro confirmaram que um ambiente local rico em citocinas como IL-6, IL-1α, dador de óxido nítrico (SNAP) e prostaglandina E2 altera a expressão genética de colagénios I, V, XI e osteocalcina em células do ligamento amarelo. No entanto, o impacto das adipocinas mencionadas no desenvolvimento da degeneração do ligamento amarelo ainda não foi determinado.

O estudo envolverá examinar as concentrações de citocinas (especialmente adipocinas) e moduladores da neuroplasticidade e a sua expressão de mRNA em tecidos rotineiramente removidos de doentes com estenose espinal e hérnia discal durante a cirurgia, bem como a recolha de sangue dos doentes duas vezes, antes do procedimento e durante uma consulta de acompanhamento dois meses após o procedimento.

Objetivos

1. Identificar diferenças nas concentrações de biomarcadores selecionados em amostras de ligamento amarelo, músculos paraespinais e gordura epidural recolhidas da região lombar de doentes com estenose em comparação com aqueles sem degeneração do canal espinal.
2. Determinar se a expressão de biomarcadores selecionados nos tecidos se correlaciona com a sua presença no sangue dos doentes e se estão relacionados com o grau de degeneração, incapacidade, intensidade da dor e massa corporal.
3. Selecionar potenciais biomarcadores para monitorizar a eficácia da cirurgia de descompressão do canal espinal através da comparação dos níveis de biomarcadores antes da cirurgia e dois meses na recuperação.
4. Identificar potenciais proteínas que modulam o metabolismo e a inflamação no ligamento amarelo.
5. Avaliar o impacto de citocinas selecionadas e do adipocinoma do tecido adiposo epidural no metabolismo e inflamação em culturas de células do ligamento amarelo.

Descrição da População do Estudo

O estudo envolverá 100 doentes do Hospital Clínico Ortopédico-Reabilitativo da Universidade de Ciências Médicas de Poznań, incluindo homens e mulheres:

• 50 doentes com estenose do canal espinal lombar, com idades entre 40-90 anos
• 50 doentes com hérnia discal intervertebral, com idades entre 18-40 anos, requerendo tratamento cirúrgico Os participantes serão submetidos a cirurgia desde que deem consentimento informado para usar os seus tecidos em investigação científica.
• O grupo de estudo será submetido a descompressão endoscópica do canal espinal, envolvendo a remoção de tecidos (osso, ligamento, articulação) que comprimem estruturas neurais, e possivelmente remoção de um fragmento de disco intervertebral deslocado.
• O grupo de controlo será submetido a cirurgia isolada de hérnia discal intervertebral, envolvendo a remoção do fragmento de disco deslocado.

Métodos Antes da cirurgia (dentro de 48h) e dois meses após a operação, serão recolhidos 20 ml de sangue venoso de cada doente.

Durante a cirurgia, serão recolhidas as seguintes amostras:

• Tecido muscular paraespinal
• Ligamento amarelo
• Tecido adiposo epidural

O estudo utilizará os seguintes métodos/ferramentas:

1. Questionários padronizados para incapacidade e intensidade da dor
2. Ressonância magnética da coluna lombar (realizada rotineiramente antes da cirurgia)

3. Testes moleculares

   1. A expressão de mRNA de citocinas (GDF-15, adipsina, vaspina, resistina, lipocalina-2, progranulina, quemerina, omentina-1) será medida usando PCR.
   2. Serão realizados imunoensaios usando kits ELISA comerciais em homogenatos de tecido e soro para determinar concentrações de proteínas (GDF-15, adipsina, vaspina, resistina, lipocalina-2, progranulina, quemerina, omentina-1)
4. Cultura celular e estimulação de células com citocinas e meio obtido de tecido adiposo Um terço do material biológico será alocado para estudos de cultura celular. Amostras do ligamento amarelo, músculos paraespinais e tecido adiposo epidural serão recolhidas diretamente após a cirurgia e colocadas em recipientes estéreis com meios de transporte apropriados.

Todas as amostras serão imediatamente transportadas para o laboratório de cultura celular em condições estéreis, no menor tempo possível desde a recolha. Após a chegada ao laboratório, serão submetidas a protocolos de isolamento celular pré-estabelecidos e apropriados, adaptados às características de cada tipo de tecido.

Após o período de exposição, serão medidas a expressão de mRNA e níveis proteicos de citocinas, marcadores de fibrose, marcadores ósseos, proteínas da matriz extracelular, enzimas de degradação da matriz no meio condicionado recolhido das culturas de miócitos e fibroblastos do ligamento amarelo.