Cytokiny, modulatory neuroplastyczności i biomarkery w zwężeniu kanału kręgowego i endoskopowej dekompresji

Zwyrodnienie kręgosłupa jest powszechnym schorzeniem układu mięśniowo-szkieletowego, które powoduje ból lub niepełnosprawność u pacjentów. Jednak patogeneza tej choroby jest złożona i nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. Zwichnięcie kanału kręgowego lędźwiowego wynika ze zmian zwyrodnieniowych struktur znajdujących się za rdzeniem kręgowym, takich jak przerost więzadła żółtego (LF), a także zwapnienie więzadła, zwyrodnienie i przerost stawów międzykręgowych i/lub przepuklina krążków międzykręgowych znajdujących się przed rdzeniem kręgowym. Patologia przerostu LF obejmuje zmiany włóknisto-chrzęstne związane z proliferacją kolagenu typu II, kostnienie, odkładanie się kryształów wapnia, degenerację włókien kolagenowych i elastycznych oraz mezmoplazję chrzęstną fibroblastów więzadła. Liczne badania naukowe próbowały zbadać etiologię przerostu i kostnienia więzadeł kręgosłupa, uwzględniając czynniki ogólnoustrojowe, miejscowe, genetyczne i środowiskowe. Jednak mechanizm rozwoju zwyrodnienia wciąż nie jest w pełni zrozumiały. Oprócz stresu mechanicznego i zwiększonej syntezy kolagenu (zwłóknienia) w więzadle, co czyni wiek głównym czynnikiem ryzyka, obecność stanu zapalnego i infiltracji makrofagów uważa się za istotny czynnik przyczyniający się do rozwoju zwyrodnienia.

Dlatego rozsądne jest założenie, że obecność stanu zapalnego związanego z innymi schorzeniami – zwłaszcza przewlekłymi – może, w nieznanym stopniu, wpływać na przebieg degeneracji struktur kręgosłupa. Obecnie otyłość i sarkopenia przyciągają szczególną uwagę jako zaburzenia wpływające na wszystkie układy ludzkiego ciała. Ponieważ ich częstość występowania wzrasta, dokładne zrozumienie ich konsekwencji dla poszczególnych narządów ma istotne znaczenie społeczne i praktyczne dla profilaktyki i ochrony zdrowia.

Rosnąca liczba doniesień wskazuje, że zaburzenia metabolizmu lipidów i wydzielanie prozapalnych adipokin i cytokin są głęboko zaangażowane w regulację fenotypów i losów komórkowych, metabolizmu macierzy zewnątrzkomórkowej oraz stanu zapalnego w procesach patofizjologicznych zwyrodnieniowych chorób kręgosłupa i stawów. Zaburzenia metaboliczne mogą wpływać na metabolizm kości i prowadzić do ektopowego kostnienia i odkładania tłuszczu nie tylko w więzadłach kręgosłupa, ale także w innych strukturach kręgosłupa. Warto również zauważyć wpływ adipokinomu na rozwój zwyrodnieniowych zaburzeń układu mięśniowo-szkieletowego. Nawet anatomicznie obecna tkanka tłuszczowa nadtwardówkowa w kanale kręgowym może ulec zapaleniu i spontanicznie wydzielać cytokiny zapalne, potencjalnie modyfikując funkcję sąsiadujących tkanek, takich jak mięśnie przykręgosłupowe i więzadła. Warto wspomnieć, że tłuszczakowatość nadtwardówkowa kręgosłupa, charakteryzująca się nadmiarem tkanki tłuszczowej w przestrzeni nadtwardówkowej prowadzącym do zwężenia kanału kręgowego, jest silnie związana z otyłością.

Dotychczas potwierdzono, że adipokiny i ich receptory, chociaż pierwotnie zlokalizowane w białej tkance tłuszczowej, występują również w chrząstce stawowej i szpiku kostnym kręgosłupa. Adipokiny mogą promować degenerację więzadła żółtego poprzez stymulowanie odpowiedzi zapalnych i promowanie zmian patologicznych. Wykazano, że leptyna znacząco koreluje z liczbą kręgów dotkniętych kostnieniem więzadłowym. Fan i in. odkryli, że leptyna znacząco zwiększa ekspresję mRNA fosfatazy alkalicznej i osteokalcyny w komórkach więzadła żółtego. Wysokie poziomy wisfatyny stwierdzono również w więzadłach żółtych u pacjentów z potwierdzonym kostnieniem. Nie ma dostępnych danych na temat obecności i roli innych cytokin pochodzących z tkanki tłuszczowej, takich jak adipsyna, waspina, rezystyna, lipokalina-2, progranulina, chemeryna, omentyna-1 lub czynnik wzrostu i różnicowania-15 (GDF-15) w więzadle żółtym. Bardzo prawdopodobne jest, że te cytokiny również są zaangażowane w rozwój zwężenia kanału kręgowego, co stanowi naszą hipotezę badawczą. Obecność i poziomy tych cytokin w tkance tłuszczowej nadtwardówkowej u pacjentów ze zwężeniem, w porównaniu z osobami bez zwężenia kanału kręgowego, nie zostały dotychczas zbadane. Ponieważ badania potwierdzają, że przewlekły stan zapalny ogólnoustrojowy wpływa na różne tkanki, a miejscowy stan zapalny znacząco wpływa na sąsiednie struktury, hipotezujemy, że więzadła, mięśnie przykręgosłupowe, krążki międzykręgowe itp. mogą być szczególnie podatne na cytokiny wydzielane przez tkankę tłuszczową nadtwardówkową. Poprzednie badania in vitro potwierdziły, że lokalne środowisko bogate w cytokiny, takie jak IL-6, IL-1α, donor tlenku azotu (SNAP) i prostaglandyna E2, zmienia ekspresję genów kolagenów I, V, XI i osteokalcyny w komórkach więzadła żółtego. Jednak wpływ wspomnianych adipokin na rozwój degeneracji więzadła żółtego nie został jeszcze określony.

Badanie będzie obejmować badanie stężeń cytokin (zwłaszcza adipokin) i modulatorów neuroplastyczności oraz ich ekspresji mRNA w tkankach rutynowo usuwanych od pacjentów ze zwężeniem kręgosłupa i przepukliną dysku podczas operacji, a także pobieranie krwi od pacjentów dwukrotnie, przed zabiegiem i podczas wizyty kontrolnej dwa miesiące po zabiegu.

Cele

1. Zidentyfikowanie różnic w stężeniach wybranych biomarkerów w próbkach więzadła żółtego, mięśni przykręgosłupowych i tłuszczu nadtwardówkowego pobranych z okolicy lędźwiowej pacjentów ze zwężeniem w porównaniu z osobami bez zwyrodnienia kanału kręgowego.
2. Określenie, czy ekspresja wybranych biomarkerów w tkankach koreluje z ich obecnością we krwi pacjentów i czy mają one związek ze stopniem zwyrodnienia, niepełnosprawności, intensywnością bólu i masą ciała.
3. Wybór potencjalnych biomarkerów do monitorowania skuteczności operacji dekompresji kanału kręgowego poprzez porównanie poziomów biomarkerów przed operacją i dwa miesiące po rekonwalescencji.
4. Zidentyfikowanie potencjalnych białek modulujących metabolizm i stan zapalny w więzadle żółtym.
5. Ocena wpływu wybranych cytokin i adipokinomu tkanki tłuszczowej nadtwardówkowej na metabolizm i stan zapalny w hodowlach komórkowych więzadła żółtego.

Opis populacji badanej

Badanie obejmie 100 pacjentów z Klinicznego Szpitala Ortopedyczno-Rehabilitacyjnego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu, w tym zarówno mężczyzn, jak i kobiety:

• 50 pacjentów ze zwężeniem kanału kręgowego lędźwiowego w wieku 40-90 lat
• 50 pacjentów z przepukliną krążka międzykręgowego w wieku 18-40 lat, wymagających leczenia operacyjnego Uczestnicy przejdą operację pod warunkiem wyrażenia świadomej zgody na wykorzystanie ich tkanek w badaniach naukowych.
• Grupa badana przejdzie endoskopową dekompresję kanału kręgowego, polegającą na usunięciu tkanek (kości, więzadła, stawu) uciskających struktury nerwowe i ewentualnie usunięciu przemieszczonego fragmentu krążka międzykręgowego.
• Grupa kontrolna przejdzie izolowaną operację przepukliny krążka międzykręgowego, polegającą na usunięciu przemieszczonego fragmentu dysku.

Metody Przed operacją (w ciągu 48h) i dwa miesiące po operacji od każdego pacjenta pobrane zostanie 20 ml krwi żylnej.

Podczas operacji zostaną zebrane następujące próbki:

• Tkanka mięśni przykręgosłupowych
• Więzadło żółte
• Tkanka tłuszczowa nadtwardówkowa

W badaniu zostaną wykorzystane następujące metody/narzędzia:

1. Standaryzowane kwestionariusze dotyczące niepełnosprawności i intensywności bólu
2. MRI odcinka lędźwiowego kręgosłupa (rutynowo wykonywane przed operacją)

3. Testy molekularne

   1. Ekspresja mRNA cytokin (GDF-15, adipsyna, waspina, rezystyna, lipokalina-2, progranulina, chemeryna, omentyna-1) będzie mierzona za pomocą PCR.
   2. Testy immunoessay z wykorzystaniem komercyjnych zestawów ELISA będą przeprowadzane na homogenatach tkanek i surowicy w celu określenia stężeń białek (GDF-15, adipsyna, waspina, rezystyna, lipokalina-2, progranulina, chemeryna, omentyna-1)
4. Hodowla komórkowa i stymulacja komórek cytokinami i podłożem uzyskanym z tkanki tłuszczowej Jedna trzecia materiału biologicznego zostanie przeznaczona na badania hodowli komórkowych. Próbki więzadła żółtego, mięśni przykręgosłupowych i tkanki tłuszczowej nadtwardówkowej będą zbierane bezpośrednio po operacji i umieszczane w sterylnych pojemnikach z odpowiednimi podłożami transportowymi.

Wszystkie próbki będą natychmiast transportowane do laboratorium hodowli komórkowych w warunkach sterylnych, w jak najkrótszym czasie od pobrania. Po przybyciu do laboratorium będą poddawane odpowiednim, wcześniej ustalonym protokołom izolacji komórek, dostosowanym do charakterystyki każdego typu tkanki.

Po okresie ekspozycji, ekspresja mRNA i poziomy białek cytokin, markerów włóknienia, markerów kostnych, białek macierzy zewnątrzkomórkowej, enzymów degradacji macierzy będą mierzone w podłożu warunkowym zebranym z hodowli miocytów i fibroblastów więzadła żółtego.