Roll av Nox2 i CNI-inducerad njurfibros (Nox2)

Calcineurin-hämmare (CNI) och njurfibros. CNIs inklusive CsA och takrolimus är hörnstenen i underhållsimmunsuppression vid solida organtransplantationer. Dessa läkemedel är så effektiva att nyare generationens CNIs som Voclosporin (Isotechnika Pharma, Inc, Edmonton, Alberta) är under utveckling. De spelar sin immunsuppressiva roll genom att hämma aktiviteten av calcineurin, ett serinfosfatas som normalt defosforylerar nukleär faktor hos aktiverade T-celler (NFAT). Defosforylerat NFAT translokeras i kärnan och inducerar transkriptionen av interleukin-2, ett viktigt cytokin för aktivering och proliferation av T-lymfocyter.

Trots deras fördelaktiga verkan vid transplantation och många autoimmuna sjukdomar, begränsas den kliniska användningen av CNIs av deras kroniska nefrotoxicitet. Detta representerar ett betydande folkhälsoproblem eftersom den 10-åriga incidensen av kronisk CNI nefrotoxicitet är 100 % hos njurtransplanterade. På liknande sätt är kronisk CNI-nefrotoxicitet den dominerande orsaken till njursvikt hos icke-njurtransplanterade organ. I denna grupp varierar 5-årsrisken för ESRD från 7 till 21 % och är associerad med en 4 gånger större risk för dödsfall. De patologiska egenskaperna hos kronisk CNI-nefrotoxicitet inkluderar progressiv och irreversibel interstitiell fibros, tubulär atrofi och arteriolära hyalina förändringar. De novo eller progressiv arteriolär hyalinförtjockning (AH) är den mest patognomoniska lesionen av kronisk CNI nefrotoxicitet. Denna lesion består av vakuolisering av endotelceller och glatta muskelceller och fokala eller cirkulära klumpiga proteinavlagringar i arteriolväggen, som vanligtvis ersätter nekrotiska glatta muskelceller och så småningom smalnar av det vaskulära lumen. Denna arteriolopati är viktig för utvecklingen av fibros. Typiskt följer fibros ett "randigt mönster" från medulla till cortex och är associerad med vakuolisering av cytoplasman i tubulära epitelceller.

Även om takrolimus är överlägsen CsA när det gäller att förbättra transplantatöverlevnaden och förhindra akut avstötning vid njurtransplantation, är de individuella nefrotoxicitetsprofilerna för dessa läkemedel liknande. På cellulära och molekylära nivåer resulterar CNIs i matrisackumulering och EMT via TGF-beta1-beroende och oberoende vägar. EMT är en viktig profibrotisk process och en surrogatmarkör för infödd och transplanterad njurfibros. TGF-beta1 är det primära cytokinet som initierar och upprätthåller EMT genom att aktivera signalvägar och transkriptionella regulatorer såsom Smad 2/3-molekyler. Under EMT omvandlas tubulära epitelceller till myofibroblaster genom en stegvis process som involverar förlust av cell-celladhesionsmolekyler (t. E-cadherin) och de novo uttryck av mesenkymala markörer (t.ex. alfa-SMA). Dessa händelser följs av tubulärt basalmembranavbrott, cellmigration och fibroblastinvasion i interstitium med produktion av profibrotiska molekyler inklusive kollagen och fibronektin. En bättre förståelse för de molekylära mekanismerna som reglerar CNI-inducerad EMT och fibros kommer att bana väg för utvecklingen av antifibrotiska strategier.

Objektiv utvärdering av njurfibros in vivo är ett nyckelsteg i denna riktning. Detta uppnåddes nyligen genom kvantitativ bedömning av njurallograftfibros med hjälp av datoriserade digitala analyser av Sirius Red. Dessa studier visade att fibros var en prognostisk indikator på långvarig njurallotransplantatfunktion och förlust. Rollen för denna teknik för att förutsäga utfall hos patienter med kronisk CNI-toxicitet är dock okänd.

CNIs och renal hypoxi. Ackumulerande bevis tyder på att kronisk tubulointerstitiell hypoxi är en sista vanlig väg till njursjukdom i slutstadiet. CNI resulterar i minskad kväveoxidproduktion och biotillgänglighet, vilket leder till minskad kärlvidgning och oavsiktlig vasokonstriktion och hypoxi. I den kroniska miljön bidrar CNI-medierad arteriolopati och förträngning av arteriolarlumen till utvecklingen av randig interstitiell fibros, förlust av peritubulära kapillärer, tubulär atrofi och glomerulär skleros. I sin tur kan hypoxi i det tubulointerstitiala utrymmet leda till bildandet av fria radikaler eller reaktiva syrearter (ROS) som orsakar cellskador och död, främjar EMT och njurfibros, vilket sätter igång en ond cirkel som kommer att sluta i slutstadiet av njursjukdom .

En bättre förståelse av de cellulära och molekylära mekanismerna som resulterar i CNI-inducerad njurhypoxi skulle leda till utvecklingen av diagnostiska och behandlingsstrategier som fördröjer eller förhindrar CNI-inducerad njurfibros. En stor begränsning av studier som behandlar intrarenal syresättning är bristen på icke-invasiva teknologier för att kvantifiera och övervaka biotillgängligheten av syre i njuren. Blodsyrenivåberoende MRI eller BOLD MRI är en innovativ avbildningsmetod som använder deoxihemoglobin som ett endogent kontrastmedel för att bestämma vävnadens syrebiotillgänglighet. Förhållandet mellan paramagnetiskt deoxihemoglobin och T2-avslappning demonstrerades första gången 1982. Denna teknik användes nyligen, inklusive av vår grupp, för att bedöma intrarenal syrebiotillgänglighet hos patienter med infödd och transplanterad njursjukdom.

Vi föreslår nu att använda denna teknik för övervakning av intrarenal syresättning hos patienter med kronisk CNI-toxicitet. Vi föreslår vidare att kombinera BOLD MRI med molekylär bedömning av renal hypoxi. Hypoxiinducerbar faktor ett alfa är ett syreresponssystem som nyligen har använts som en molekylär markör för njurhypoxi. HIF-molekyler regleras på proteinnivå av syreberoende enzymer och tillåter därför detektering av vävnadshypoxi. I njurallotransplantatet till exempel, tyder den starka korrelationen mellan HIF-1alfa-färgning och klinisk/subklinisk avstötning att hypoxi är involverad i patogenesen av den immunmedierade njurskadan och att HIF-1 alfa-immunhistokemi kan förbättra den specifika diagnosen akut avstötning .

Pimonidazol är också en molekylär biomarkör för hypoxi som en gång levererad in vivo, binder till tiolgrupper vid syrespänningar under 10 mmHg och visualiseras med kommersiellt tillgängliga antipimonidazolantikroppar. Det är en liten, effektiv och ogiftig radiosensibilisator som används som hypoximarkör för humana skivepitelcancer i livmoderhalsen, huvudet och halsen. I njurarna har pimonidazolfärgning använts för att undersöka vävnadshypoxi i experimentella modeller av kronisk njursjukdom och akut CNI nefrotoxicitet. Rollen av BOLD MRI, HIF-1 alfa och pimonidazol vid utvärdering av mekanismerna för kronisk CNI-inducerad hypoxi har inte utvärderats.

CNIs och Nox2. CsA är en pro-oxidant molekyl som stöds av experimentella studier som tyder på att vitamin E hämmar CsA-inducerad lipidperoxidation och njurskador. På liknande sätt reducerade katalas, ett enzym som specifikt bryter ned den reaktiva väteperoxiden (H2O2) till H2O och O2 och fungerar som en renhållare av ROS, CsA-associerad njurtubulär epitelcellsåldring. Dessutom ackumulerar proximala tubulära epitelceller från råtta som exponeras för CsA intracellulära ROS och lipidperoxidationsprodukter, tillsammans med ett förändrat glutationredoxtillstånd. De molekylära mekanismerna som reglerar CNI-inducerad generering av ROS förblir dock oklara.

Ursprungligen hette gp91phox, Nox2 är det klassiska fagocytiska NADPH-oxidaset, ett enzym som är naturligt involverat i immunsvaret inklusive den "oxidativa explosionen". Nox2 är också det ursprungliga identifierade exemplet på ett system som genererar ROS som den primära funktionen av enzymet och inte som en biprodukt som mitokondrien eller peroxisomer. Det är en av de sju för närvarande kända Nox-isoformerna, är konstitutivt associerad med det transmembranstabiliserande proteinet p22phox och kräver rekrytering av cytosoliska komponenter p47phox, p67phox och p40phox för funktion.

Sammanfattningsvis är CNIs, ryggraden i anti-avstötningsterapier, också profibrotiska molekyler, vilket gör det svårt att effektivt hantera immunsuppression och långsiktiga resultat. Vi skisserar forskningsstudier som noggrant bedömer rollen av Nox2 i CNI-inducerad njurfibros. Dessutom föreslår vi samtida och kompletterande kliniska och translationella strategier för att undersöka de molekylära mekanismerna som reglerar Nox2-aktivitet under CNI-medierad fibrogenes. Om de lyckas kommer resultaten av våra studier att ge ett betydande steg framåt i utformningen av nya diagnostiska, övervaknings- och behandlingsalternativ som syftar till att kompensera för de skadliga effekterna av immunsuppressiv terapi och förbättra långsiktiga njurresultat vid organtransplantation.