Ruolo di Nox2 nella fibrosi renale indotta da CNI (Nox2)

Inibitori della calcineurina (CNI) e fibrosi renale. CNI tra cui CsA e tacrolimus sono la pietra angolare dell'immunosoppressione di mantenimento nel trapianto di organi solidi. Questi farmaci sono così efficaci che sono in fase di sviluppo CNI di nuova generazione come Voclosporin (Isotechnika Pharma, Inc, Edmonton, Alberta). Svolgono il loro ruolo immunosoppressivo inibendo l'attività della calcineurina, una serina fosfatasi che normalmente defosforila il fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT). L'NFAT defosforilato trasloca nel nucleo e induce la trascrizione dell'interleuchina-2, una citochina importante per l'attivazione e la proliferazione dei linfociti T.

Nonostante le loro azioni benefiche nei trapianti e in molte malattie autoimmuni, l'uso clinico delle CNI è limitato dalla loro nefrotossicità cronica. Ciò rappresenta un significativo problema di salute pubblica poiché l'incidenza a 10 anni di nefrotossicità cronica da CNI è del 100% nei riceventi di trapianto renale. Allo stesso modo, la nefrotossicità cronica da CNI è il fattore causale dominante per l'insufficienza renale nei trapiantati di organi non renali. In questo gruppo, il rischio a 5 anni di ESRD varia dal 7 al 21% ed è associato a un rischio di morte 4 volte maggiore. Le caratteristiche patologiche della nefrotossicità cronica da CNI comprendono la fibrosi interstiziale progressiva e irreversibile, l'atrofia tubulare e le alterazioni ialine arteriolari. L'ispessimento ialino arteriolare (AH) de novo o progressivo è la lesione più patognomonica della nefrotossicità cronica CNI. Questa lesione consiste nella vacuolizzazione delle cellule muscolari lisce e endoteliali e nei depositi proteici grumosi focali o circolari nella parete arteriolare, che di solito sostituiscono le cellule muscolari lisce necrotiche e alla fine restringono il lume vascolare. Questa arteriolopatia è importante per lo sviluppo della fibrosi. Tipicamente, la fibrosi segue un "modello a strisce" dal midollo alla corteccia ed è associata alla vacuolizzazione del citoplasma nelle cellule epiteliali tubulari.

Sebbene tacrolimus sia superiore a CsA nel migliorare la sopravvivenza del trapianto e prevenire il rigetto acuto nel trapianto di rene, i profili individuali di nefrotossicità di questi farmaci sono simili. A livello cellulare e molecolare, i CNI provocano l'accumulo di matrice e l'EMT tramite percorsi dipendenti e indipendenti dal TGF-beta1. L'EMT è un importante processo profibrotico e un marker surrogato della fibrosi renale nativa e trapiantata. TGF-beta1 è la citochina primaria che avvia e mantiene EMT attivando vie di segnalazione e regolatori trascrizionali come le molecole Smad 2/3. Durante l'EMT, le cellule epiteliali tubulari vengono trasformate in miofibroblasti attraverso un processo graduale che comporta la perdita di molecole di adesione cellula-cellula (ad es. E-caderina) ed espressione de novo di marcatori mesenchimali (es. alfa-SMA). Questi eventi sono seguiti da rottura della membrana basale tubolare, migrazione cellulare e invasione di fibroblasti nell'interstizio con produzione di molecole profibrotiche tra cui collagene e fibronectina. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari che regolano l'EMT e la fibrosi indotti da CNI aprirà la strada allo sviluppo di strategie antifibrotiche.

La valutazione obiettiva della fibrosi renale in vivo è un passo fondamentale in questa direzione. Ciò è stato recentemente ottenuto mediante la valutazione quantitativa della fibrosi del trapianto renale utilizzando analisi digitali computerizzate di Sirius Red. Questi studi hanno dimostrato che la fibrosi era un indicatore prognostico della funzionalità e della perdita di allotrapianto renale a lungo termine. Tuttavia, il ruolo di questa tecnologia nella previsione degli esiti nei pazienti con tossicità cronica da CNI è sconosciuto.

CNI e ipossia renale. Prove sempre più numerose suggeriscono che l'ipossia tubulo-interstiziale cronica è un percorso finale comune verso la malattia renale allo stadio terminale. I CNI determinano una diminuzione della produzione e della biodisponibilità di ossido nitrico (NO), portando così a una diminuzione della vasodilatazione e vasocostrizione incontrastata e ipossia. Nel contesto cronico, l'arteriolopatia mediata da CNI e il restringimento del lume arteriolare contribuiscono allo sviluppo della fibrosi interstiziale striata, alla perdita dei capillari peritubulari, all'atrofia tubulare e alla sclerosi glomerulare. A sua volta, l'ipossia del compartimento tubulointerstiziale può portare alla formazione di radicali liberi o specie reattive dell'ossigeno (ROS) che causano lesioni cellulari e morte, promuovendo EMT e fibrosi renale, innescando un circolo vizioso che si concluderà con una malattia renale allo stadio terminale .

Una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che provocano l'ipossia renale indotta da CNI porterebbe allo sviluppo di strategie diagnostiche e terapeutiche che ritardano o prevengono la fibrosi renale indotta da CNI. Una delle principali limitazioni degli studi che affrontano l'ossigenazione intrarenale è la mancanza di tecnologie non invasive per quantificare e monitorare la biodisponibilità dell'ossigeno nel rene. La risonanza magnetica dipendente dal livello di ossigeno nel sangue o BOLD MRI è un metodo di imaging innovativo che utilizza la deossiemoglobina come agente di contrasto endogeno per determinare la biodisponibilità dell'ossigeno nei tessuti. La relazione tra deossiemoglobina paramagnetica e rilassamento T2 è stata dimostrata per la prima volta nel 1982. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata, anche dal nostro gruppo, per valutare la biodisponibilità di ossigeno intra-renale in pazienti con malattia renale nativa e trapiantata.

Proponiamo ora di utilizzare questa tecnologia per il monitoraggio dell'ossigenazione intrarenale in pazienti con tossicità cronica da CNI. Suggeriamo inoltre di combinare BOLD MRI con la valutazione molecolare dell'ipossia renale. L'ipossia Inducible Factor one alpha è un sistema di risposta all'ossigeno che è stato recentemente utilizzato come marcatore molecolare dell'ipossia renale. Le molecole HIF sono regolate a livello proteico da enzimi dipendenti dall'ossigeno e quindi consentono il rilevamento dell'ipossia tissutale. Nell'allotrapianto renale, ad esempio, la forte correlazione tra colorazione HIF-1alfa e rigetto clinico/subclinico suggerisce che l'ipossia è coinvolta nella patogenesi del danno renale immuno-mediato e che l'immunoistochimica di HIF-1 alfa potrebbe migliorare la diagnosi specifica di rigetto acuto .

Il pimonidazolo è anche un biomarcatore molecolare dell'ipossia che, una volta somministrato in vivo, si lega ai gruppi tiolici a tensioni di ossigeno inferiori a 10 mmHg e viene visualizzato con anticorpi antipimonidazolo disponibili in commercio. È un radiosensibilizzante piccolo, efficace e non tossico utilizzato come marcatore di ipossia per i carcinomi a cellule squamose umane della cervice, della testa e del collo. Nel rene, la colorazione con pimonidazolo è stata utilizzata per esaminare l'ipossia tissutale in modelli sperimentali di malattia renale cronica e nefrotossicità acuta da CNI. Il ruolo di BOLD MRI, HIF-1 alfa e pimonidazolo nella valutazione dei meccanismi dell'ipossia cronica indotta da CNI non è stato valutato.

CNI e Nox2. CsA è una molecola pro-ossidante come supportato da studi sperimentali che suggeriscono che la vitamina E inibisce la perossidazione lipidica indotta da CsA e il danno renale. Allo stesso modo, la catalasi, un enzima che scompone specificamente il perossido di idrogeno reattivo (H2O2) in H2O e O2 e agisce come scavenger di ROS, ha ridotto la senescenza delle cellule epiteliali tubulari renali associate a CsA. Inoltre, le cellule epiteliali tubulari prossimali del ratto esposte a CsA accumulano ROS intracellulari e prodotti di perossidazione lipidica, insieme a uno stato redox alterato del glutatione. Tuttavia, i meccanismi molecolari che regolano la generazione di ROS indotta da CNI rimangono poco chiari.

Originariamente chiamato gp91phox, Nox2 è la classica NADPH ossidasi fagocitica, un enzima che è naturalmente coinvolto nella risposta immunitaria compreso il "burst ossidativo". Nox2 è anche l'esempio originale identificato di un sistema che genera ROS come funzione primaria dell'enzima e non come sottoprodotto come il mitocondrio oi perossisomi. È una delle sette isoforme Nox attualmente conosciute, è costitutivamente associata alla proteina stabilizzante transmembrana p22phox e richiede il reclutamento dei componenti citosolici p47phox, p67phox e p40phox per la sua funzione.

In sintesi, i CNI, la spina dorsale delle terapie anti-rigetto, sono anche molecole profibrotiche, che rendono difficile gestire efficacemente l'immunosoppressione e gli esiti a lungo termine. Descriviamo studi di ricerca che valutano rigorosamente il ruolo di Nox2 nella fibrosi renale indotta da CNI. Inoltre, proponiamo strategie cliniche e traslazionali contemporanee e complementari per esaminare i meccanismi molecolari che regolano l'attività di Nox2 durante la fibrogenesi mediata da CNI. In caso di successo, i risultati dei nostri studi forniranno un significativo passo avanti nella progettazione di nuove opzioni diagnostiche, di monitoraggio e trattamento volte a compensare gli effetti deleteri della terapia immunosoppressiva e migliorare gli esiti renali a lungo termine nel trapianto di organi.