BiHiVE2-studie. Undersökningen och valideringen av prediktiva biomarkörer vid hypoxisk-ischemisk encefalopati. (BiHiVE2)

Bakgrund och aktuell kunskap inom området:

Perinatal asfyxi är en av de vanligaste orsakerna till neonatal död och långvarig funktionsnedsättning, som förekommer hos 20 av 1000 levande födda. Av dessa kommer cirka 2-3 av 1000 att utveckla hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE) (1). I Irland och Storbritannien är HIE den tredje vanligaste orsaken till neonatal dödlighet, och står för 9 % av alla dödsfall och 21 % av dödsfallen på sikt, medan den globalt beräknas orsaka över 1 miljon neonatal dödsfall varje år. För de överlevande finns signifikant sekundär sjuklighet associerad, inklusive cerebral pares (15 %), allvarlig kognitiv försening (11 %), anfallsrubbningar (8 %), sensorisk-neural dövhet (7 %) och synförlust (3 %)( 2).

HIE är en föränderlig process, som kan förenklas till två förolämpningar. Den initiala förolämpningen är signifikant cerebral hypoxi och/eller ischemi som följs av energiutarmning, från anaerob metabolism som leder till ackumulering av laktat och förlust av cellulär integritet. Detta sätter igång en kaskad av händelser med den resulterande bildandet av fria radikaler, proteaser och kaspaser som leder till cellskador och apoptos, den sekundära förolämpningen(3). Det sekundära energiavbrottet har visat sig inträffa mellan 6-48 timmar efter den första förolämpningen.

Tills nyligen fanns ingen terapeutisk intervention som kunde minska den associerade sjukligheten eller dödligheten. De senaste publikationerna av flera internationella studier och deras efterföljande metaanalys har dock visat att tidig inducerad hypotermi är fördelaktigt vid HIE, vilket förbättrar överlevnaden och minskar neurologisk funktionsnedsättning (4-5). Inducerad hypotermi har nu blivit en standardvård vid måttlig/svår HIE. Men för att vara effektiv måste den påbörjas inom 6 timmar efter leverans, innan det sekundära energiavbrottet inträffar. I detta snäva tidsfönster måste befolkningen som skulle dra nytta av behandling identifieras, återupplivas, stabiliseras och kylas.

Tyvärr är förmågan att känna igen och diagnostisera de som skulle ha nytta av terapi inte alltid möjlig inom denna tidsperiod. Vi har visat att de nuvarande standardmetoderna för att identifiera de som löper risk för HIE såsom syra-basbalans, laktat- och Apgar-poäng och initial neurologisk bedömning är otillförlitliga (6). Neonatal elektroencefalografi (EEG) är användbar för att gradera encefalopati och är en utmärkt prediktor för långsiktiga resultat. I synnerhet dess utveckling under de första 24 timmarna efter förlossningen korrelerar starkt med resultatet (7). Det kräver dock en högt specialiserad kompetens som sällan är tillgänglig för neonatologen i den akuta miljön. Amplitudintegrerad EEG används mer allmänt av kliniker, men dess tolkning är användarberoende, och majoriteten av neonatologer rapporterar att de inte är säkra på sin egen tolkningsförmåga (8). Behovet av tidig och tillförlitlig förutsägelse av utfall i HIE har aldrig varit större. En snabb, billig, reproducerbar, icke-användarberoende metod för att kvantifiera svårighetsgraden av HIE och trolig prognos är ett akut behov. Många biokemiska och hematologiska markörer har föreslagits vid perinatal asfyxi, men ingen har lett till kliniska framsteg eller kommersiellt gångbara tester vid sängkanten (9).

Under de senaste 2 åren, här på Cork University Maternity Hospital, har vi genom BIHIVE-studien (Biomarkers in Hypoxic-Ischemic Encephalopathy study) identifierat potentiella biokemiska markörer i navelsträngsblod som exakt kan identifiera de spädbarn som kommer att utvecklas till måttlig/svår encefalopati (10,11). BIHIVE-studien har antagit ett mångfacetterat tillvägagångssätt för att identifiera blodburna biomarkörer i HIE genom 1) riktad proteomisk profilering med Luminex-teknik 2) miRNA-profilering 3) omfattande kartläggning av blodmetabolomen med användning av både masspektrometri och tekniker för kärnmagnetisk resonans.

Vårt mål är att rekrytera en kohort av spädbarn med tydligt definierad perinatal asfyxi och HIE, klassificerade med både upprepad neurologisk bedömning och flerkanals EEG. Vid tidpunkten för födseln kommer navelsträngsblod att tas, bearbetas och fyllas på med strikta standardförfaranden (SOP) som vi har utvecklat för detta ändamål. Dessa procedurer kommer att säkerställa att alla prover kommer att vara lämpliga för senare proteomisk, metabolomisk, transkriptomisk och genomisk analys. Med hjälp av ett systembiologiskt tillvägagångssätt har vi studerat flera föreslagna markörer i det lagrade navelsträngsblodet från vår upptäcktskohort, initialt med fokus på proteomen och metabolomen. Genom detta arbete har vi redan identifierat ett antal biomarkörer som finns i navelsträngsblod med potential att förutsäga utvecklingen av måttlig/svår HIE. Vår tidiga data är extremt lovande. Vår initiala metabolomiska analys har visat att vi kan skilja mellan HIE och kontroller med en area under kurvan (AUROC) på 0,92. Ytterligare analys kommer att krävas för att identifiera och kvantifiera de exakta metabolittoppar som producerar denna differentiering. Vi vill nu validera dessa fynd i ytterligare en kohort av spädbarn med perinatal asfyxi och HIE, och att validera vår förmåga att förutsäga neurologiska resultat på längre sikt. Vårt pilotarbete med att undersöka mikroRNA-förändringar i navelsträngsblodet hos spädbarn med måttlig/svår HIE är också mycket uppmuntrande med betydande uppreglering av ett flertal studerade miRNA vid både asfyxi och HIE. De mest lovande miRNA-sekvenserna kvantifieras nu med användning av polymeraskedjereaktion (PCR)-amplikation och kommer att valideras i upptäcktskohorten.

Framtida kohort-BIHIVE2: För att utveckla dessa markörer vidare till den punkt där vi har validerat en markör med >90 % sensitivitet och specificitet för måttlig/svår HIE kommer vi att behöva rekrytera ytterligare en kohort av noggrant rekryterade spädbarn med högkvalitativ biobank vid födseln och detaljerad klinisk fenotypning. Detta är huvudarbetet i denna nuvarande applikation. Vi kommer att kräva ytterligare en kohort på 300 spädbarn med perinatal asfyxi, av vilka 60 kommer att utveckla HIE och 30 kommer att utveckla måttlig till svår HIE. Vi kommer också att behöva rekrytera 300 samtida kontrollspädbarn. För att rekrytera detta antal spädbarn med perinatal asfyxi kommer vi att behöva studera 30 000 levande födda. Vi har därför utökat våra studiecentra till att omfatta Karolinska Universitetssjukhuset, Stockholm, ett stort toppmodernt förlossningssjukhus med 10 000 levande födda per år.

Ytterligare validering kommer att tillåta oss att utveckla en algoritm av kliniska och biokemiska markörer som kommer att tillhandahålla ett känsligt och specifikt prediktivt test för måttlig/svår HIE. Neuroutvecklingsuppföljning av båda kohorterna kommer att tillåta oss att bedöma vår förmåga att förutsäga neuroutvecklings- och beteenderesultat efter 2 år.

Slutligen kommer vi att undersöka den exakta tidpunkten för förändring av biomarkörer med hjälp av en tidsinställd djurmodell av hypoxisk-ischemisk skada (HI). I kliniska studier är hypoxisk-ischemisk skada oförutsägbar och tidpunkten är ofta omöjlig att uppskatta. Dr Tracey Bjorkmann vid Queen's University, Brisbane har utvecklat en smågrismodell av HI som producerar HI framkallar anfall och en skadenivå som motsvarar måttlig till svår HIE (12). Hon har gått med på att samarbeta med vårt program och kommer att ge smågrisprover av serum som tagits 0,1,2 och 12 timmar efter HI. Dessa prover kommer att vara ovärderliga för att undersöka utvecklingen av störningar av biomarkörer och kommer att hjälpa oss att tajma neonatal hjärnskada efter förlossningen.