Studio BiHiVE2. L'indagine e la convalida dei biomarcatori predittivi nell'encefalopatia ipossico-ischemica. (BiHiVE2)

Background e conoscenze attuali nel settore:

L'asfissia perinatale è una delle cause più comuni di morte neonatale e disabilità a lungo termine, che si verifica nel 20 per 1000 nati vivi. Di questi, circa 2-3 su 1000 svilupperanno l'encefalopatia ipossico-ischemica (HIE) (1). In Irlanda e nel Regno Unito l'HIE è la terza causa più comune di mortalità neonatale, rappresentando il 9% di tutti i decessi e il 21% dei decessi a termine, mentre a livello globale si stima che causi oltre 1 milione di decessi neonatali ogni anno. Per i sopravvissuti vi è una significativa morbilità secondaria associata, tra cui paralisi cerebrale (15%), grave ritardo cognitivo (11%), disturbi convulsivi (8%), sordità neurosensoriale (7%) e perdita della vista (3%) ( 2).

HIE è un processo in evoluzione, che può essere semplificato in due insulti. L'insulto iniziale è una significativa ipossia cerebrale e/o ischemia seguita da deplezione energetica, dal metabolismo anaerobico che porta all'accumulo di lattato e alla perdita dell'integrità cellulare. Ciò mette in moto una cascata di eventi con la conseguente formazione di radicali liberi, proteasi e caspasi che portano al danno cellulare e all'apoptosi, l'insulto secondario(3). È stato dimostrato che l'interruzione di energia secondaria si verifica tra 6 e 48 ore dopo l'insulto iniziale.

Fino a poco tempo fa non esisteva alcun intervento terapeutico che potesse ridurre la morbilità o la mortalità associate. Tuttavia le recenti pubblicazioni di numerosi studi internazionali e la loro successiva meta-analisi hanno dimostrato che l'ipotermia precoce indotta è benefica nell'HIE, migliorando la sopravvivenza e riducendo la disabilità neurologica (4-5). L'ipotermia indotta è ora diventata uno standard di cura nell'HIE moderata/severa. Tuttavia, per essere efficace, deve essere avviato entro 6 ore dalla consegna, prima che si verifichi l'interruzione di energia secondaria. In questo ristretto lasso di tempo la popolazione che trarrebbe beneficio dal trattamento deve essere identificata, rianimata, stabilizzata e raffreddata.

Sfortunatamente la capacità di riconoscere e diagnosticare coloro che trarrebbero beneficio dalla terapia non è sempre possibile entro questo periodo di tempo. Abbiamo dimostrato che gli attuali metodi standard per identificare i soggetti a rischio di HIE come l'equilibrio acido-base, il punteggio del lattato e di Apgar e la valutazione neurologica iniziale sono inaffidabili (6). L'elettroencefalografia neonatale (EEG) è utile per la classificazione dell'encefalopatia ed è un eccellente predittore di esito a lungo termine. In particolare la sua evoluzione nelle prime 24 ore successive al parto è fortemente correlata all'esito (7). Tuttavia richiede un set di abilità altamente specializzato che raramente è disponibile per il neonatologo in ambito acuto. L'EEG integrato in ampiezza è più ampiamente utilizzato dai medici, ma la sua interpretazione dipende dall'utente e la maggior parte dei neonatologi riferisce di non essere sicura della propria capacità interpretativa (8). La necessità di una previsione precoce e affidabile dell'esito nell'HIE non è mai stata così grande. Un metodo rapido, economico, riproducibile e non dipendente dall'utente per quantificare la gravità dell'HIE e la probabile prognosi è una necessità urgente. Molti marcatori biochimici ed ematologici sono stati proposti nell'asfissia perinatale, ma nessuno ha portato a progressi clinici o test al letto del paziente commercialmente fattibili (9).

Negli ultimi 2 anni, qui al Cork University Maternity Hospital, attraverso lo studio BIHIVE (Biomarkers in Hypoxic-Ischaemic Encephalopathy study) abbiamo identificato potenziali marcatori biochimici nel sangue del cordone ombelicale che possono identificare con precisione quei neonati che progrediranno a moderata/grave encefalopatia (10,11). Lo studio BIHIVE ha adottato un approccio poliedrico per identificare i biomarcatori ematici nell'HIE attraverso 1) profilazione proteomica mirata utilizzando la tecnologia Luminex 2) profilazione miRNA 3) mappatura completa del metaboloma del sangue utilizzando tecniche sia di spettrometria di massa che di risonanza magnetica nucleare.

Il nostro obiettivo è reclutare una coorte di neonati con asfissia perinatale chiaramente definita e HIE, classificati utilizzando sia la valutazione neurologica ripetuta che l'EEG multicanale. Al momento della nascita, il sangue del cordone ombelicale verrà prelevato, processato e conservato, utilizzando rigorose procedure operative standard (SOP) che abbiamo sviluppato a tale scopo. Queste procedure assicureranno che tutti i campioni saranno adatti per successive analisi proteomiche, metabolomiche, trascrittomiche e genomiche. Utilizzando un approccio di biologia dei sistemi, abbiamo studiato più marcatori proposti nel sangue del cordone ombelicale immagazzinato dalla nostra coorte di scoperta, concentrandoci inizialmente sul proteoma e sul metaboloma. Attraverso questo lavoro abbiamo già identificato una serie di biomarcatori presenti nel sangue del cordone ombelicale con il potenziale per predire lo sviluppo di HIE moderata/grave. I nostri primi dati sono estremamente promettenti. La nostra analisi metabolomica iniziale ha dimostrato che possiamo distinguere tra HIE e controlli con un'area sotto la curva (AUROC) di 0,92. Saranno necessarie ulteriori analisi per identificare e quantificare i picchi esatti del metabolita che producono questa differenziazione. Desideriamo ora convalidare questi risultati in un'ulteriore coorte di neonati con asfissia perinatale e HIE e convalidare la nostra capacità di prevedere l'esito neurologico a lungo termine. Anche il nostro lavoro pilota che esamina i cambiamenti dei microRNA nel sangue del cordone ombelicale di neonati con EIO moderata/grave è molto incoraggiante con una significativa sovraregolazione di un multiplo miRNA studiato sia nell'asfissia che nell'EIO. I miRNA più promettenti vengono ora quantificati utilizzando l'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) e saranno convalidati nella coorte di scoperta.

Futura coorte-BIHIVE2: per sviluppare ulteriormente questi marcatori fino al punto in cui abbiamo convalidato un marcatore con sensibilità e specificità >90% per HIE moderato/severo, avremo bisogno di reclutare un'ulteriore coorte di neonati reclutati con cura con biobanche di alta qualità alla nascita e fenotipizzazione clinica dettagliata. Questo è il lavoro principale di questa applicazione attuale. Avremo bisogno di un'ulteriore coorte di 300 neonati con asfissia perinatale, di cui 60 svilupperanno HIE e 30 svilupperanno HIE da moderata a grave. Dovremo anche reclutare 300 neonati di controllo contemporanei. Per reclutare questo numero di neonati con asfissia perinatale dovremo studiare 30.000 nati vivi. Abbiamo quindi ampliato i nostri centri di studio per includere il Karolinska University Hospital di Stoccolma, un grande ospedale di maternità all'avanguardia con 10.000 nati vivi all'anno.

Un'ulteriore validazione ci consentirà di sviluppare un algoritmo di marcatori clinici e biochimici che fornirà un test predittivo sensibile e specifico per l'HIE moderato/severo. Il follow-up dello sviluppo neurologico di entrambe le coorti ci consentirà di valutare la nostra capacità di prevedere l'esito dello sviluppo neurologico e comportamentale a 2 anni.

Infine esamineremo l'esatta tempistica dell'alterazione del biomarcatore utilizzando un modello animale temporizzato di danno ipossico-ischemico (HI). Negli studi clinici il danno ipossico-ischemico è imprevedibile e la sua tempistica è spesso impossibile da stimare. La dott.ssa Tracey Bjorkmann della Queen's University, Brisbane, ha sviluppato un modello di HI sui maialini che produce HI che induce convulsioni e un livello di lesione pari a HIE da moderato a grave (12). Ha accettato di collaborare con il nostro programma e fornirà campioni di siero di suinetti prelevati a 0,1,2 e 12 ore dopo l'HI. Questi campioni saranno preziosi per esaminare la progressione dello squilibrio dei biomarcatori e ci aiuteranno a cronometrare la lesione cerebrale neonatale dopo il parto.