使用高次谐波发生显微镜验证早期肺癌采样的快速现场诊断 (VALIDIAG)

诊断所有疑似恶性肿瘤（例如肺癌）的金标准包括使用光学显微镜进行病理检查，并辅以免疫组织化学技术和分子（组织）诊断。 该组织的官方评估通常在获得组织的程序之后通过组织学分析（组织分析）或细胞学分析（通过抽吸获得的细胞分析）进行。 只有这样才能确定所获得的组织是否在质量上足够和/或在数量上足以做出诊断。

为了确保以正确的结果测量来执行复杂和/或侵入性手术，术中组织诊断将是有益的。 除了术后评估之外，用于定性和定量估计的额外术中材料评估（“快速现场评估”（ROSE）和“冰冻切片检查”）通常用于复杂和/或侵入性手术。 在导航支气管镜检查过程中始终需要对细胞病理学进行快速现场评估，而冰冻切片检查则用于手术组织切除（例如肺癌手术，以及肿瘤耳鼻喉科和食管手术，以及其他器官和恶性肿瘤怀疑） 。

导航支气管镜检查 对于（疑似）早期肺癌患者，导航支气管镜检查是一项劳动密集型、复杂的手术，现已成为诊断疑似肺癌异常的新护理标准。 内窥镜和随后的导航导管用于通过自然气道导航到可疑病变并进行活检以做出诊断。 由于这些通常是外围小病变，因此获得毫米级精度的组织至关重要。 在导航支气管镜检查过程中，前面提到的 ROSE 技术通常用于在手术过程中接收有关所获得的组织是否适合进行诊断的反馈。 在导航支气管镜检查期间使用小型仪器收集组织学和/或细胞学组织，例如充满细胞材料的载玻片。 细胞学分析人员在几分钟内通过着色并在显微镜下检查材料来评估材料是否具有代表性。 代表性意味着材料包含足够的内容来进行最终的病理诊断以解释异常。 由于导航支气管镜仅涉及小活检，并且在直接可视化下无法确定地获得肿瘤本身或周围组织的组织（活检是在 X 射线荧光镜检查的指导下进行的），因此需要进行多次和广泛的活检。 在目前的临床实践中，每个患者通常要进行十次以上的活检。 在实践中，我们通过术中影像观察发现，90%以上的病例都能准确到达病灶。 在后来的跟踪中发现，在大约10-15%的手术中，我们在分析所获得的材料后仍然无法提供正确的诊断。

手术 与导航支气管镜检查期间的 ROSE 类似，当手术开始时没有可用的诊断或临床相关淋巴结站影响干预时，也需要在手术过程中进行冰冻切片检查。 采集组织后，一名员工将其带到病理科。 手术过程暂停。 将组织在病理科冷冻以切割切片，然后由病理学家对切片进行着色和评估。 由于这些活动，这意味着外科医生在手术期间通常要等待半个多小时才能得到病理结果。

这种方法在许多外科手术中都很常见，不仅在肺部手术中，而且在食道癌、头颈癌和身体其他部位的其他实体瘤患者的手术中也是如此。

在许多临床情况下，在手术过程中提供更快、更详细的病理反馈，可以立即了解异常的起源，可以显着改善临床实践。 可以缩短手术等待时间，缩小准确到达病变部位和获得诊断之间的差距。 它可以更有效地确定导航支气管镜检查等诊断过程中所需的活检数量，并可以在术中更准确地评估是否需要进一步治疗。

高次谐波产生显微镜 高次谐波产生显微镜 (HHGM) 是一种新颖的数字成像技术，可以在手术过程中使用激光生成（数字）显微镜图像。 该技术可生成具有亚细胞分辨率的非侵入性、无标记的活体组织数字图像。 图像中的对比度是由不连续性、非中心对称分子结构或自荧光细胞器引起的，产生更高的光学谐波和自荧光光子，可以用显微镜检测到。 HHGM 之前已应用于各种组织类型的成像，例如乳房、大脑和肺部。 早期的一项研究表明，HHGM 在几分钟内即可提供肺部肿瘤的高质量图像，无需固定和染色。 所得图像揭示了肿瘤的细胞密度、细胞和核形态特征，以及细胞外基质成分（成纤维细胞、胶原蛋白和弹性蛋白）、免疫细胞、红细胞和血管。 在阿姆斯特丹 UMC 随后的一项研究中，来自 47 名患者的 109 个活检组织在切除后平均 6 分钟（IQR = 3 分钟）内进行了成像。 图像质量足以诊断 97% 的活检中的恶性肿瘤或非恶性肿瘤，并且病理学家对 87% 的 HHG 图像进行了正确评分。

重要的是，事实证明这种光学成像对标准病理处理和评估没有影响。 获得图像后，可以立即根据正常程序对成像组织进行处理和评估。 在阿姆斯特丹 UMC 之前对人类肺组织（47 名患者）进行的一项研究中，病理学家对 HHG 显微镜成像后拍摄的组织病理学图像进行了评估。 研究发现，使用 HHG 显微镜成像对组织或其可及性也没有影响。 照射在样品上的激光功率为5 mW，相当于激光笔的功率。

获得的组织在根据常规临床流程进一步处理之前，被放置在用于 HHGM 成像的特殊容器中。 例如，在导航支气管镜检查过程中获得的小活检组织和需要较长扫描时间的较大手术切除组织都放置在这些特殊容器中，并在成像过程中通过添加少量生理盐水（一滴到几滴）进行最低程度的润湿。 这样做是为了改善成像并防止潜在的脱水。 添加生理盐水对病理学家随后对组织进行评估的可能性没有负面影响。

这里描述的研究协议旨在在日常临床实践的常规程序中收集大量 HHGM 图像，创建更广泛的图像库以理解 HHGM 图像，培训病理学家，并为未来的计算机辅助诊断和/或开发 AI 算法。或自动现场诊断。 手术期间收集的图像不会用于临床决策。