Validering av snabb diagnostik på plats i tidigt skede av lungcancerprovtagning med ett mikroskop av högre harmonisk generation (VALIDIAG)

Guldstandarden för att diagnostisera alla misstänkta maligniteter, såsom lungcancer, innebär patologisk undersökning med ljusmikroskopi, kompletterad med immunhistokemiska tekniker och molekylär (vävnads)diagnostik. Den officiella bedömningen av denna vävnad sker vanligtvis efter det förfarande där vävnaden erhölls, genom histologisk analys (vävnadsanalys) eller cytologisk analys (cellanalys erhållen genom aspiration). Först då kan säkerhet ges om den erhållna vävnaden är kvalitativt adekvat och/eller kvantitativt tillräcklig för att ställa en diagnos.

För att säkerställa att komplexa och/eller invasiva ingrepp utförs med korrekta resultatmått, skulle intraoperativ vävnadsdiagnostik vara fördelaktigt. Förutom postoperativ bedömning används ofta ytterligare intra-procedurell utvärdering av material för kvalitativ och kvantitativ uppskattning ('snabb utvärdering på plats' (ROSE) och 'fryst snittundersökning') för komplexa och/eller invasiva procedurer. Snabb utvärdering av cytopatologi på plats är alltid närvarande vid navigeringsbronkoskopi, medan undersökning av fryst snitt används för kirurgisk vävnadsresektion (såsom vid lungcancerkirurgi, såväl som vid onkologisk ÖNH och matstrupskirurgi, bland annat misstankar om organ och malignitet) .

Navigationsbronkoskopi För patienter med (misstanke om) lungcancer i tidigt skede är navigeringsbronkoskopi ett arbetsintensivt, komplext ingrepp som nu har blivit den nya standarden för vård för att diagnostisera avvikelser som är misstänkta för lungcancer. Ett endoskop och en efterföljande navigerbar kateter används för att navigera genom de naturliga luftvägarna till den misstänkta lesionen och få en biopsi för att ställa en diagnos. Eftersom dessa ofta är perifera små lesioner är det avgörande att få fram vävnad med millimeterprecision. Vid navigationsbronkoskopi används rutinmässigt den tidigare nämnda ROSE-tekniken för att under ingreppet få feedback på om den erhållna vävnaden är lämplig för att ställa en diagnos. Histologisk och/eller cytologisk vävnad samlas in med hjälp av små instrument under navigeringsbronkoskopi, såsom ett objektglas fyllt med cellmaterial. Cytologianalytikern bedömer inom några minuter om materialet är representativt genom att färga och undersöka det i mikroskop. Representativitet innebär att materialet innehåller tillräckligt för att utföra slutlig patologidiagnostik för att förklara avvikelsen. Eftersom navigationsbronkoskopi endast involverar små biopsier och vävnad från själva tumören eller omgivande vävnad inte erhålls med säkerhet under direkt visualisering (biopsier tas under ledning av röntgenfluoroskopi), utförs flera och omfattande biopsier. I nuvarande klinisk praxis tas rutinmässigt mer än tio biopsier per patient. I praktiken observerar vi under intraoperativ avbildning att vi exakt kunde nå lesionen i mer än 90% av fallen. Vid senare uppföljning visar det sig att vi i cirka 10-15 % av ingreppen fortfarande inte kan ge en korrekt diagnos efter att ha analyserat det erhållna materialet.

Kirurgi I likhet med ROSE vid navigationsbronkoskopi, begärs även undersökning av fryst snitt vid kirurgiska ingrepp när det inte finns någon diagnos tillgänglig vid ingreppets början eller när kliniskt relevanta lymfkörtelstationer påverkar interventionen. Vävnad tas och en anställd tar med den till patologiavdelningen. Förloppet av det kirurgiska ingreppet pausas. Vävnaden fryses på patologiavdelningen för att skära snitt som sedan färgas och bedöms av patologen. På grund av dessa aktiviteter innebär detta att kirurgen vanligtvis väntar i mer än en halvtimme på ett patologiskt resultat under operationen.

Detta tillvägagångssätt är vanligt vid många kirurgiska ingrepp, inte bara vid lungkirurgi utan även vid ingrepp för patienter med esofaguscancer, huvud- och halscancer och andra solida tumörer på andra ställen i kroppen.

I många kliniska situationer kan snabbare och mer detaljerad patologisk återkoppling tillgänglig under en procedur, vilket ger omedelbara insikter om ursprunget till avvikelser, avsevärt förbättra den kliniska praxisen. Väntetiderna för proceduren kan förkortas, vilket överbryggar gapet mellan att exakt nå en lesion och att få en diagnos. Det möjliggör en mer effektiv bestämning av antalet biopsier som behövs under diagnostiska procedurer som navigationsbronkoskopi och möjliggör en mer exakt intraoperativ bedömning av om ytterligare terapi är nödvändig.

Higher Harmonic Generation Microscopy Higher Harmonic Generation Microscopy (HHGM) är en ny digital avbildningsteknik som kan generera (digitala) mikroskopibilder med hjälp av laserljus under en procedur. Denna teknik producerar icke-invasiva, etikettfria digitala bilder av levande vävnad med subcellulär upplösning. Kontrasten i bilderna orsakas av diskontinuiteter, icke-centrosymmetriska molekylära strukturer eller autofluorescerande organeller, som genererar högre optiska övertoner och autofluorescerande fotoner, som detekteras med ett mikroskop. HHGM har tidigare använts för att avbilda olika vävnadstyper, såsom bröst, hjärna och lungor. En tidigare studie visade att HHGM ger högkvalitativa bilder av lungtumörer inom några minuter utan fixering och färgning. De resulterande bilderna avslöjade celldensitet, cellulära och nukleära morfologiska egenskaper hos tumören, såväl som extracellulära matriskomponenter (fibroblaster, kollagen och elastin), immunceller, röda blodkroppar och blodkärl. I en efterföljande studie vid Amsterdam UMC avbildades 109 biopsier från 47 patienter inom en median av 6 minuter (IQR = 3 minuter) efter excision. Bildkvaliteten var tillräcklig för att diagnostisera malignitet eller icke-malignitet i 97 % av biopsierna, och 87 % av HHG-bilderna bedömdes korrekt av patologer.

Viktigt, det visades att denna optiska avbildning inte hade någon inverkan på den vanliga patologiska bearbetningen och utvärderingen. Den avbildade vävnaden kunde bearbetas och bedömas enligt normal rutin omedelbart efter att bilderna erhölls. I en tidigare studie på mänsklig lungvävnad vid Amsterdam UMC (47 patienter) utvärderades histopatologiska bilder tagna efter avbildning med HHG-mikroskopet av en patolog. Det visade sig att avbildning med HHG-mikroskop inte heller hade någon effekt på vävnaden eller dess tillgänglighet. Lasereffekten på provet är 5 mW, vilket motsvarar effekten av en laserpekare.

De erhållna vävnaderna, innan vidare bearbetning i enlighet med rutinmässiga kliniska processer, placeras i en speciell behållare för HHGM-avbildning. Både de små biopsierna som erhållits, till exempel under navigationsbronkoskopi, och större kirurgiska resektionsvävnader som kräver längre skanningstider placeras i dessa speciella behållare, minimalt fuktade genom att tillsätta en liten mängd fysiologisk koksaltlösning (en droppe till flera droppar) under avbildning. Detta görs för att förbättra bildbehandlingen och förhindra potentiell uttorkning. Denna tillsats av fysiologisk saltlösning har ingen negativ effekt på patologens senare bedömningsmöjligheter av vävnaden.

Forskningsprotokollet som beskrivs här syftar till att samla in ett stort antal HHGM-bilder under rutinprocedurer i daglig klinisk praxis, skapa ett mer omfattande bibliotek av bilder för att förstå HHGM-bilder, utbilda patologer och utveckla en AI-algoritm för framtida datorstödd diagnostik och/ eller automatisk diagnostik på plats. Bilderna som samlas in under proceduren kommer inte att användas för kliniskt beslutsfattande.