Walidacja szybkiej diagnostyki na miejscu w pobieraniu próbek raka płuc we wczesnym stadium za pomocą mikroskopu generującego wyższe harmoniczne (VALIDIAG)

Złotym standardem w diagnostyce wszystkich podejrzanych nowotworów złośliwych, takich jak rak płuc, jest badanie patologiczne z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej, uzupełnione technikami immunohistochemicznymi i diagnostyką molekularną (tkankową). Oficjalna ocena tej tkanki następuje zazwyczaj po zabiegu, w ramach którego uzyskano tkankę, poprzez analizę histologiczną (analiza tkanki) lub analizę cytologiczną (analiza komórek uzyskana poprzez aspirację). Tylko wtedy można mieć pewność, czy uzyskana tkanka jest jakościowo i/lub ilościowo wystarczająca do postawienia diagnozy.

Aby mieć pewność, że złożone i/lub inwazyjne procedury zostaną przeprowadzone z właściwymi wynikami, korzystna byłaby śródoperacyjna diagnostyka tkanek. Oprócz oceny pooperacyjnej, w przypadku skomplikowanych i/lub inwazyjnych procedur często stosuje się dodatkową wewnątrzzabiegową ocenę materiału w celu oceny jakościowej i ilościowej („szybka ocena na miejscu” (ROSE) i „badanie skrawków zamrożonych”). Szybka ocena cytopatologiczna na miejscu jest zawsze konieczna podczas zabiegów bronchoskopii nawigacyjnej, natomiast badanie zamrożonych skrawków wykorzystuje się w przypadku chirurgicznej resekcji tkanek (m.in. w chirurgii raka płuc, a także w onkologicznej laryngologii i chirurgii przełyku, między innymi w przypadku podejrzeń narządów i nowotworów złośliwych). .

Bronchoskopia nawigacyjna W przypadku pacjentów z (podejrzeniem) wczesnego stadium raka płuc bronchoskopia nawigacyjna jest pracochłonną i złożoną procedurą, która obecnie stała się nowym standardem postępowania w diagnostyce nieprawidłowości podejrzanych o raka płuc. Endoskop, a następnie cewnik umożliwiający nawigację, służą do nawigowania naturalnymi drogami oddechowymi do podejrzanej zmiany i uzyskania biopsji w celu postawienia diagnozy. Ponieważ są to często niewielkie zmiany obwodowe, istotne jest uzyskanie tkanki z milimetrową precyzją. Podczas bronchoskopii nawigacyjnej rutynowo wykorzystuje się wspomnianą wcześniej technikę ROSE, aby w trakcie zabiegu uzyskać informację zwrotną, czy pobrana tkanka nadaje się do postawienia diagnozy. Tkankę histologiczną i/lub cytologiczną pobiera się podczas bronchoskopii nawigacyjnej za pomocą małych instrumentów, takich jak szkiełko wypełnione materiałem komórkowym. Analityk cytologiczny w ciągu kilku minut ocenia, czy materiał jest reprezentatywny, barwiąc go i oglądając pod mikroskopem. Reprezentatywność oznacza, że ​​materiał zawiera wystarczającą ilość materiału do przeprowadzenia ostatecznej diagnostyki patologicznej w celu wyjaśnienia nieprawidłowości. Ponieważ bronchoskopia nawigacyjna obejmuje jedynie niewielkie biopsje, a podczas bezpośredniej wizualizacji nie można z całą pewnością uzyskać tkanki samego guza lub otaczającej go tkanki (biopsje wykonuje się pod kontrolą fluoroskopii rentgenowskiej), wykonuje się wielokrotne i rozległe biopsje. W obecnej praktyce klinicznej rutynowo wykonuje się ponad dziesięć biopsji u jednego pacjenta. W praktyce podczas badań obrazowych śródoperacyjnych obserwujemy, że w ponad 90% przypadków udało nam się dokładnie dotrzeć do zmiany. W dalszej obserwacji okazuje się, że w około 10-15% zabiegów nadal po analizie uzyskanego materiału nie jesteśmy w stanie postawić prawidłowej diagnozy.

Chirurgia Podobnie jak w przypadku ROSE podczas bronchoskopii nawigacyjnej, badanie skrawków zamrożonych jest również wymagane podczas zabiegów chirurgicznych, gdy na początku zabiegu nie można postawić diagnozy lub gdy na interwencję wpływają klinicznie istotne stacje węzłów chłonnych. Pobiera się tkankę, a pracownik przynosi ją na oddział patologii. Postęp zabiegu operacyjnego zostaje wstrzymany. Tkankę zamraża się na oddziale patologii w celu wycięcia skrawków, które następnie są barwione i oceniane przez patologa. Dzięki tym czynnościom chirurg czeka zazwyczaj w trakcie operacji na wynik patologii ponad pół godziny.

Takie podejście jest stosowane w wielu zabiegach chirurgicznych, nie tylko w chirurgii płuc, ale także w zabiegach u pacjentów z rakiem przełyku, rakiem głowy i szyi oraz innymi guzami litymi w innych częściach ciała.

W wielu sytuacjach klinicznych szybsza i bardziej szczegółowa informacja patologiczna dostępna w trakcie zabiegu, zapewniająca natychmiastowy wgląd w przyczynę nieprawidłowości, mogłaby znacząco poprawić praktykę kliniczną. Czas oczekiwania na zabieg można skrócić, wypełniając lukę pomiędzy dokładnym dotarciem do zmiany chorobowej a postawieniem diagnozy. Umożliwia skuteczniejsze określenie liczby biopsji potrzebnych podczas zabiegów diagnostycznych takich jak bronchoskopia nawigacyjna oraz pozwala na dokładniejszą śródoperacyjną ocenę konieczności dalszego leczenia.

Mikroskopia generacji wyższych harmonicznych Mikroskopia generacji wyższych harmonicznych (HHGM) to nowatorska technika obrazowania cyfrowego, która umożliwia generowanie (cyfrowych) obrazów mikroskopowych przy użyciu światła lasera podczas zabiegu. Technika ta umożliwia uzyskanie nieinwazyjnych, pozbawionych etykiet cyfrowych obrazów żywej tkanki o rozdzielczości subkomórkowej. Kontrast na obrazach jest spowodowany nieciągłościami, niecentrosymetrycznymi strukturami molekularnymi lub organellami autofluorescencyjnymi, generującymi wyższe harmoniczne optyczne i fotony autofluorescencyjne, które są wykrywane pod mikroskopem. HHGM stosowano już wcześniej do obrazowania różnych typów tkanek, takich jak pierś, mózg i płuca. Wcześniejsze badanie wykazało, że HHGM zapewnia wysokiej jakości obrazy guzów płuc w ciągu kilku minut bez utrwalania i barwienia. Uzyskane obrazy ujawniły gęstość komórek, komórkowe i jądrowe cechy morfologiczne guza, a także składniki macierzy pozakomórkowej (fibroblasty, kolagen i elastyna), komórki odpornościowe, czerwone krwinki i naczynia krwionośne. W kolejnym badaniu przeprowadzonym w Amsterdamie UMC 109 biopsji od 47 pacjentów wykonano w ciągu mediany 6 minut (IQR = 3 minuty) po wycięciu. Jakość obrazu była wystarczająca do rozpoznania nowotworu złośliwego lub niezłośliwego w 97% biopsji, a 87% obrazów HHG zostało poprawnie ocenionych przez patologów.

Co ważne, wykazano, że to obrazowanie optyczne nie ma wpływu na standardowe przetwarzanie i ocenę patologiczną. Natychmiast po uzyskaniu obrazów obrazowaną tkankę można poddać obróbce i ocenie zgodnie z normalną procedurą. W poprzednim badaniu ludzkiej tkanki płucnej w Amsterdamie UMC (47 pacjentów) obrazy histopatologiczne wykonane po obrazowaniu za pomocą mikroskopu HHG zostały ocenione przez patologa. Stwierdzono, że obrazowanie za pomocą mikroskopu HHG również nie miało wpływu na tkankę ani jej dostępność. Moc lasera działającego na próbkę wynosi 5 mW, co odpowiada mocy wskaźnika laserowego.

Pobrane tkanki przed dalszą obróbką zgodnie z rutynowymi procesami klinicznymi umieszczane są w specjalnym pojemniku do obrazowania HHGM. Do tych specjalnych pojemników umieszcza się zarówno małe biopsje uzyskiwane np. podczas bronchoskopii nawigacyjnej, jak i większe tkanki po resekcji chirurgicznej, wymagające dłuższego czasu skanowania, minimalnie zwilżane poprzez dodanie podczas obrazowania niewielkiej ilości soli fizjologicznej (od kropli do kilku kropli). Ma to na celu poprawę obrazowania i zapobieganie potencjalnemu odwodnieniu. Dodatek soli fizjologicznej nie wpływa negatywnie na późniejszą ocenę tkanki przez patologa.

Opisany tutaj protokół badawczy ma na celu zebranie dużej liczby obrazów HHGM podczas rutynowych procedur w codziennej praktyce klinicznej, utworzenie obszerniejszej biblioteki obrazów w celu zrozumienia obrazów HHGM, szkolenia patologów i opracowania algorytmu sztucznej inteligencji na potrzeby przyszłej diagnostyki wspomaganej komputerowo i/lub lub automatyczną diagnostykę na miejscu. Obrazy zebrane podczas zabiegu nie będą wykorzystywane do podejmowania decyzji klinicznych.