Validace rychlé diagnostiky na místě v časném stadiu odběru vzorků rakoviny plic pomocí mikroskopu vyšší harmonické generace (VALIDIAG)

Zlatým standardem diagnostiky všech suspektních malignit, jako je karcinom plic, je patologické vyšetření pomocí světelné mikroskopie, doplněné imunohistochemickými technikami a molekulární (tkáňovou) diagnostikou. Oficiální posouzení této tkáně se obvykle provádí po postupu, při kterém byla tkáň získána, prostřednictvím histologické analýzy (analýza tkáně) nebo cytologické analýzy (analýza buněk získaná aspirací). Jen tak lze poskytnout jistotu, zda je získaná tkáň kvalitativně a/nebo kvantitativně dostatečná pro stanovení diagnózy.

Aby bylo zajištěno, že komplexní a/nebo invazivní postupy budou prováděny se správnými výsledky, byla by prospěšná intraoperační diagnostika tkáně. Kromě pooperačního hodnocení se u složitých a/nebo invazivních postupů často používá dodatečné intraprocedurální hodnocení materiálu pro kvalitativní a kvantitativní odhad („rychlé hodnocení na místě“ (ROSE) a „vyšetření zmrazeného řezu“). Rychlé vyhodnocení cytopatologie na místě je vždy přítomno během navigačních bronchoskopických výkonů, zatímco vyšetření zmrazených řezů se používá pro chirurgickou resekci tkáně (jako je například chirurgie rakoviny plic, stejně jako onkologická chirurgie ORL a jícnu, mimo jiné podezření na orgány a malignitu) .

Navigační bronchoskopie Pro pacienty s (s podezřením na) rané stadium rakoviny plic je navigační bronchoskopie pracným a komplexním postupem, který se nyní stal novým standardem péče pro diagnostiku abnormalit podezřelých z rakoviny plic. Endoskop a následný navigovatelný katétr se používají k navigaci přirozenými dýchacími cestami k podezřelé lézi a získání biopsie pro stanovení diagnózy. Protože se často jedná o malé periferní léze, je zásadní získat tkáň s milimetrovou přesností. Při navigační bronchoskopii se již dříve zmíněná technika ROSE rutinně používá k získání zpětné vazby během výkonu, zda je získaná tkáň vhodná pro stanovení diagnózy. Histologická a/nebo cytologická tkáň se odebírá pomocí malých nástrojů během navigační bronchoskopie, jako je sklíčko naplněné buněčným materiálem. Cytologický analytik během několika minut vyhodnotí, zda je materiál reprezentativní, obarvením a zkoumáním pod mikroskopem. Reprezentativnost znamená, že materiál obsahuje dostatek pro provedení konečné patologické diagnostiky k vysvětlení abnormality. Vzhledem k tomu, že navigační bronchoskopie zahrnuje pouze malé biopsie a tkáň ze samotného nádoru nebo okolní tkáně se při přímé vizualizaci nezískává s jistotou (biopsie se odebírají pod vedením rentgenové fluoroskopie), provádí se mnohočetné a rozsáhlé biopsie. V současné klinické praxi se běžně odebírá více než deset biopsií na pacienta. V praxi pozorujeme při intraoperačním zobrazení, že jsme mohli přesně dosáhnout léze ve více než 90 % případů. Při pozdějším sledování se ukazuje, že asi u 10-15 % výkonů stejně nedokážeme po rozboru získaného materiálu stanovit správnou diagnózu.

Chirurgie Podobně jako u ROSE při navigační bronchoskopii je vyšetření zmrazených řezů vyžadováno také během chirurgických zákroků, kdy na začátku zákroku není k dispozici žádná diagnóza nebo když zákrok ovlivňují klinicky relevantní stanice lymfatických uzlin. Odebere se tkáň a zaměstnanec ji přinese na patologické oddělení. Průběh chirurgického zákroku je pozastaven. Tkáň se na patologickém oddělení zmrazí na řezy, které se následně obarví a posoudí patologem. Díky těmto činnostem to znamená, že chirurg během operace obvykle čeká déle než půl hodiny na výsledek patologie.

Tento přístup je obvyklý u mnoha chirurgických zákroků, nejen u plicních, ale také u pacientů s rakovinou jícnu, rakovinou hlavy a krku a dalšími solidními nádory jinde v těle.

V mnoha klinických situacích by rychlejší a podrobnější patologická zpětná vazba dostupná během výkonu, poskytující okamžitý pohled na původ abnormalit, mohla významně zlepšit klinickou praxi. Čekací doby zákroku lze zkrátit, čímž se překlene mezera mezi přesným dosažením léze a stanovením diagnózy. Umožňuje efektivnější stanovení počtu biopsií potřebných při diagnostických výkonech, jako je navigační bronchoskopie, a umožňuje přesnější intraoperační posouzení nutnosti další terapie.

Mikroskopie vyšší harmonické generace Mikroskopie vyšší harmonické (HHGM) je nová digitální zobrazovací technika, která může generovat (digitální) mikroskopické obrazy pomocí laserového světla během postupu. Tato technika vytváří neinvazivní digitální snímky živé tkáně bez štítků se subcelulárním rozlišením. Kontrast v obrazech je způsoben diskontinuitami, necentrosymetrickými molekulárními strukturami nebo autofluorescenčními organelami, které generují vyšší optické harmonické a autofluorescenční fotony, které jsou detekovány mikroskopem. HHGM se dříve používal k zobrazení různých typů tkání, jako je prsa, mozek a plíce. Dřívější studie prokázala, že HHGM poskytuje vysoce kvalitní snímky plicních nádorů během několika minut bez fixace a barvení. Výsledné snímky odhalily hustotu buněk, buněčné a jaderné morfologické rysy nádoru, stejně jako složky extracelulární matrix (fibroblasty, kolagen a elastin), imunitní buňky, červené krvinky a krevní cévy. V následné studii v Amsterdam UMC bylo zobrazeno 109 biopsií od 47 pacientů v mediánu 6 minut (IQR = 3 minuty) po excizi. Kvalita obrazu byla dostatečná pro diagnostiku malignity nebo nemalignity u 97 % biopsií a 87 % HHG obrazů bylo patology správně ohodnoceno.

Důležité je, že bylo prokázáno, že toto optické zobrazení nemělo žádný vliv na standardní patologické zpracování a hodnocení. Zobrazená tkáň mohla být zpracována a hodnocena podle běžné rutiny ihned po získání snímků. V předchozí studii na lidské plicní tkáni v Amsterdam UMC (47 pacientů) byly histopatologické snímky pořízené po zobrazení pomocí mikroskopu HHG hodnoceny patologem. Bylo zjištěno, že zobrazování pomocí HHG mikroskopu také nemělo žádný vliv na tkáň nebo její dostupnost. Výkon laseru na vzorku je 5 mW, což odpovídá výkonu laserového ukazovátka.

Získané tkáně jsou před dalším zpracováním v souladu s rutinními klinickými procesy umístěny do speciální nádoby pro zobrazování HHGM. Do těchto speciálních nádob jsou umístěny jak malé biopsie získané např. při navigační bronchoskopii, tak i větší chirurgické resekční tkáně vyžadující delší dobu skenování, minimálně zvlhčené přidáním malého množství fyziologického roztoku (kapka až několik kapek) během zobrazování. To se provádí za účelem zlepšení zobrazování a zabránění potenciální dehydrataci. Toto přidání fyziologického roztoku nemá žádný negativní vliv na pozdější možnosti posouzení tkáně patologem.

Zde popsaný výzkumný protokol si klade za cíl shromáždit velké množství snímků HHGM během rutinních postupů v každodenní klinické praxi, vytvořit rozsáhlejší knihovnu snímků pro pochopení snímků HHGM, školení patologů a vývoj algoritmu umělé inteligence pro budoucí počítačově podporovanou diagnostiku a/nebo nebo automatickou diagnostiku na místě. Snímky shromážděné během procedury nebudou použity pro klinické rozhodování.