5-azacytidin kyselina valproová a ATRA u AML a vysoce rizikového MDS

Demetylace chromatinu Kromě acetylace histonu deacetylace je hypermethylace promotoru dalším důležitým a relevantním mechanismem zapojeným do regulace genové transkripce (přehled v Herman, 2003). Remodelace chromatinu by tak mohla být také cílena pomocí nukleosidových analogů, jako je 5-azacytidin nebo decitabin, které reaktivují genovou transkripci prostřednictvím demethylace DNA (Silverman, 2001). Nedávno byla ve studiích VITRO získána indukce genové exprese pomocí 5 AzaC v primárních buňkách AML a MDS mechanismy závislými a nezávislými na metylaci DNA (SCHMELZ, 2005)

Opět bylo prokázáno, že AzaC je schopen vyvolat klinické hematologické odpovědi u pacientů s MDS. Kontrolovaná studie provedená US Cancer and Leukemia Group B (CALBG) uvádí u těchto pacientů vyšší míru odezvy, nižší výskyt leukemické transformace a prodloužené přežití ve srovnání se samotnou podpůrnou péčí Silverman, 2002. Probíhá další potvrzující studie fáze 3.

AzaC v kombinaci s kyselinou valproovou v leukemické buněčné linii (HL60 a MOLT4 prokázal synergickou aktivitu k indukci genové reexprese (reaktivace p21 CIP1) a synergický efekt ve smyslu inhibice růstu, indukce apoptózy (Yang H, 2005 ).

Acetylace histonů Mnoho výzkumných skupin se pokusilo objasnit molekulární mechanismy, které jsou základem diferenciace indukované ATRA u buněk NB4, čerstvých buněk APL, myší s APL nebo pacientů s APL (Melnick 1999). Jedním z hlavních problémů bylo pochopit klíčovou roli fúzního proteinu PML RARα v diferenciační odpovědi na RA. Nejprve bylo pozorováno, že terapeutické koncentrace ATRA vedly k přetvoření jaderných tělísek PML spojených se štěpením fúzního proteinu PML RARa. Zmizení tohoto fúzního produktu, který působí jako dominantní negativní regulátor transkripce cílových genů RA, poskytlo vysvětlení pro opakování procesu diferenciace. Dominantní negativní role PML RARα byla za druhé vysvětlena asociací fúzního proteinu s korepresorovým komplexem N-CoR-SMRT-Sin3, což vedlo k náboru aktivit histondeacetylázy (HDAC) ak nedostatku transkripce cílových genů (REDNER, 1999 ). Zajímavé je, že podobný nábor aktivit korepresoru HDAC byl hlášen u jiných leukemických fúzních genů, včetně PLZF RARα, AML1 ETO, CBFß MYH11 a akutní leukémie TEL AML1. V buňkách PML RARα APL umožňují terapeutické koncentrace ATRA uvolnění aktivit korepresoru HDAC, acetylaci histonů, remodelaci chromatinu a transkripci cílových genů potenciálně odpovědných za terminální granulocytární diferenciaci (REDNER, 1999; DILWORK, 2001). Z tohoto pohledu je ATRA terapie APL prvním příkladem genově cílené terapie, která se specificky zaměřuje na patogenní genetické abnormality u lidské leukémie.

In VITRO a in vivo rezistence na ATRA-indukovanou diferenciaci pozorovaná u pacientů s PLZF RARα leukemie souvisí s účinnějším náborem korepresorových HDAC aktivit v této podskupině APL ve srovnání s klasickou PML-RARα APL (dvě vazebná místa korepresoru na PLZF místo jednoho na PML). Velmi zajímavé je, že nedávno bylo prokázáno, že leukemické buňky PLZF RARα nejsou ve skutečnosti zcela rezistentní vůči indukci diferenciace, zvláště pokud jsou podávány vhodné COSTIMULI. Za prvé, tyto buňky se mohou diferencovat v přítomnosti vyšší koncentrace ATRA (3 mikroM místo 1 mikroM).

Za druhé přidání inhibitoru HDAC (trichostatin A) obnovuje citlivost ATRA na 1 mikroM (KITAMURY 2000).

Za třetí, signalizace G CSF může tyto buňky donutit podstoupit terminální diferenciaci (JANSEN 2001).

Bylo také prokázáno, že inhibitory HDAC jsou schopné vyvolat remisi u transgenních modelů akutní promyelocytární leukémie rezistentní na terapii (He 2001).

Citlivost buněk HL60, které nevykazují žádné chromozomální přeuspořádání zahrnující lokus RARα, na diferenciaci vyvolanou RA může souviset s těmito pozorováními. Lze předpokládat, že některé neznámé COSTIMULI včetně událostí remodelace chromatinu přispívají k citlivosti RA buněk HL60.

Z terapeutického hlediska vedou tato pozorování k vyhodnocení necílených transkripčních terapií kombinujících ATRA s necílenými inhibitory HDAC a/nebo induktory cAMP u leukémií bez APL. Ze známých inhibitorů HDAC (trichostatin A, trapoxin A, butyrát, oxamflatin, depsipeptid a MS 275) byl fenylbutyrát sodný úspěšně podáván v kombinaci s ATRA pacientovi s klinicky ATRA rezistentním APL (WARRELL, 1998). Tato kazuistika představuje první příklad cílené transkripční terapie u lidské leukémie. Nedávno bylo prokázáno, že kyselina valproová (VPA) patří do rodiny inhibitorů HDAC (PHIEL, 2001). Kyselina valproová je mastná kyselina s krátkým řetězcem široce používaná jako antikonvulzivum a stabilizátor nálady.

Charakteristické zpoždění odpovědi na VPA a její teratogenní potenciál vedly dlouhou dobu k návrhu, že působí prostřednictvím modulace genové exprese. Bylo také popsáno, že VPA může aktivovat transkripci závislou na AP1 (ASGHARI, 1998; Chen, 1999 1; Yuan, 2001) a upregulovat bcl 2 (Chen, 1999 2). Nedávno bylo také prokázáno, že VPA je schopna vyvolat diferenciaci buněk teratokarcinomu F9, o kterých je známo, že jsou také schopny diferenciace v přítomnosti RA nebo cAMP (WERLING, 2001). A konečně, VPA může senzibilizovat neoplastické buňky na proapoptotické stimuly prostřednictvím inhibice glutathion (GSH) reduktázy, enzymu potřebného pro udržení vysokých buněčných hladin sníženého GSH (Moog, 1996), nebo inhibicí dráhy NF-κB (ICHIYAMA, 2000). Je zajímavé, že se také ukázalo, že chlorid lithný (další stabilizátor nálady) působí synergicky s ATRA k indukci terminální diferenciace leukemických buněk WEHI-3B. Jak bylo pozorováno u kombinace ATRA a G CSF, zdálo se, že tento pozorovaný synergismus souvisí s prevencí ztráty proteinu RAR obvykle pozorované při expozici ATRA (Finch, 2000).

Zajímavé je, že VPA jako jediná látka nebo podávaná v kombinaci s ATRA byla nedávno prokázána jako schopná vyvolat klinické hematologické odpovědi u pacientů léčených pro myelodysplastické syndromy (KUENDGEN, 2004). V této studii se zdálo, že pro další pozitivní účinky ATRA je nutná předléčba VA.

Kyselina retinová:

Retinoidy představují velkou skupinu sloučenin strukturně příbuzných vitamínu A (retinolu). Působí prostřednictvím vazby a aktivace specifických jaderných receptorů, které vážou DNA. Kyselina retinová (RA), přírodní kyselý derivát retinolu, je klíčovým diferenciačním faktorem zapojeným do specifických fází embryonálního vývoje, diferenciace zrakového systému a (zde zajímavého) hemopoetického zrání granulocytů (CORNIC, 1994). Ve VITRO byla prokázána schopnost RA indukovat granulocytární diferenciaci buněčné linie HL60. Tato buněčná linie byla založena v roce 1977 od pacienta s AML. Buňky se do značné míry podobají promyelocytům, ale mohou být indukovány k terminální diferenciaci. Některá činidla, včetně RA, způsobují, že se buňky HL60 diferencují na buňky podobné granulocytům, jiná na buňky podobné monocytům/makrofágům. Buněčný genom HL60 obsahuje zesílený protoonkogen c-myc a hladiny c-myc mRNA rychle klesají po indukci diferenciace (BIRNIE, 1988).

Opakované změny genu kódujícího receptor RA alfa (RARα, lokalizovaný na chromozomu 17q12) jsou spojeny s některými podskupinami akutní myeloidní leukémie (AML). Nejběžnější změnou genu RARα je reciproční t(15;17) chromozomální translokace pozorovaná u velké většiny akutní promyelocytární leukémie (APL) odpovídající podskupině AML-M3 francouzsko-americké-britské (FAB) klasifikace. Tato translokace fúzuje gen RARα s genem PML (umístěným na chromozomu 15q21), což vede k fúzním produktům PML-RARα. Variantní translokace fúzující gen RARα s dalšími partnery včetně PLZF na chromozomu 11, NPM na chromozomu 5, NuMA na chromozomu 11 a STAT5 na chromozomu 17 byly hlášeny zřídka nebo příležitostně. Kauzální role fúzních proteinů RARα (alespoň PML-RARα a PLZF-RARα) v APL byla prokázána na myších modelech (KOGAN, 1999). Bylo ukázáno, že tyto fúzní proteiny mohou působit jako dominantní transkripční represor v APL buňkách (Melnick, 1999).

Buněčná linie NB4 byla založena v roce 1991 od pacienta s APL (LANOTTE, 1991). Tato buněčná linie byla široce používána ke studiu biologie tohoto onemocnění. Na rozdíl od HL60 nese NB4 translokaci t(15;17). Stejně jako v buňkách HL60 je RA schopna indukovat granulocytární diferenciaci buněk NB4 vedoucí k buněčné smrti prostřednictvím terminální indukce apoptózy. Tyto diferenciační účinky byly potvrzeny in vivo pomocí různých myších modelů APL (KOGAN, 1999; He, 1999).

Na základě těchto předklinických pozorování byla pacientům s APL úspěšně podávána perorální all-trans RA (ATRA). U pacientů s relabující APL indukuje léčba první linie ATRA (45 mg/m2/den) in vivo diferenciaci leukemických promyelocytů na abnormální granulocyty, které stále nesou fúzi PML-RARα, což vede k přibližně 90% hematologické remisi a 20% molekulární remisi míry, jak byly hodnoceny specifickou PML-RARa RT-PCR negativací (Huang, 1988; CASTAIGNE, 1990; DEGOS, 1995). To představovalo první příklad diferenciační terapie u lidské leukémie. Bohužel takové příznivé účinky nebyly pozorovány u pacientů s jinými subtypy AML při léčbě ATRA za použití podobného dávkování a schématu. V návaznosti na tyto výsledky získané u pacientů s relabující APL byla pak ATRA hodnocena v kombinaci s chemoterapií během první linie léčby nově diagnostikovaných pacientů s APL. Několik kontrolovaných studií zavedlo kombinaci ATRA-chemoterapie jako současnou standardní léčbu nově diagnostikované APL. Nejlepších výsledků se zřejmě dosáhne, když se ATRA a chemoterapeutika podávají současně.

Ke zvýšení citlivosti na RA u buněk rezistentních na RA lze zvážit další terapeutické intervence. Ve skutečnosti vysvětlení RA rezistence zahrnují RA-indukovanou zvýšenou expresi izoforem cytochromu P450 (CYP), RA-indukovanou zvýšenou expresi cytoplazmatických RA-vazebných proteinů typu II (CRABP-II), nadměrnou expresi P-glykoproteinu (P-gp) a získané mutace oblasti vázající ligand genu RARα. Látky interagující s metabolismem ATRA, jako jsou inhibitory HIV-1 proteázy (indinavir, ritonavir, saquinavir), které inhibují CYP a P-gp a soutěží s ATRA o vazbu CRABP-I, by mohly zvýšit indukci diferenciace v RA-rezistentních buňkách (IKEZOE , 2000).