5-Azacytidin-Valproinsäure und ATRA bei AML und Hochrisiko-MDS

Chromatin-Demethylierung Neben der Histon-Acetylierung ist die Promotor-Hypermethylierung ein weiterer wichtiger und relevanter Mechanismus, der an der Regulation der Gentranskription beteiligt ist (Übersicht in Herman, 2003). Der Chromatin-Remodeling könnte daher auch mit Nukleosidanaloga wie 5-Azacytidin oder Decitabin angegangen werden, die die Gentranskription durch DNA-Demethylierung reaktivieren (Silverman, 2001). Kürzlich wurde in in VITRO-Studien die Induktion der Genexpression durch 5 AzaC in primären AML- und MDS-Zellen durch DNA-Methylierungs-abhängige und -unabhängige Mechanismen erhalten (SCHMELZ, 2005)

Auch hier wurde gezeigt, dass AzaC klinische hämatologische Reaktionen bei Patienten mit MDS hervorrufen kann. Eine kontrollierte Studie, die von der US Cancer and Leukemia Group B (CALBG) durchgeführt wurde, hat eine höhere Ansprechrate, eine geringere Inzidenz von leukämischen Transformationen und ein verlängertes Überleben im Vergleich zu unterstützender Behandlung allein bei diesen Patienten berichtet Silverman, 2002. Eine weitere bestätigende Phase-3-Studie ist im Gange.

AzaC hat in Kombination mit Valproinsäure in leukämischen Zelllinien (HL60 und MOLT4) eine synergistische Aktivität zur Induktion der Genexpression (Reaktivierung von p21 CIP1) und eine synergistische Wirkung in Bezug auf Wachstumshemmung und Induktion von Apoptose gezeigt (Yang H, 2005 ).

Histonacetylierung Zahlreiche Forschergruppen haben versucht, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die der ATRA-induzierten Differenzierung in NB4-Zellen, frischen APL-Zellen, APL-Mäusen oder APL-Patienten zugrunde liegen (Melnick 1999). Eines der Hauptprobleme bestand darin, die entscheidende Rolle des PML-RARα-Fusionsproteins bei der Differenzierungsreaktion auf RA zu verstehen. Es wurde zuerst beobachtet, dass therapeutische Konzentrationen von ATRA zur Neubildung von PML-Kernkörpern führten, die mit einer Spaltung des PML-RARα-Fusionsproteins verbunden war. Das Verschwinden dieses Fusionsprodukts, das als dominanter negativer Regulator der Transkription von RA-Zielgenen wirkt, lieferte eine Erklärung für die Wiederholung des Differenzierungsprozesses. Die dominierende negative Rolle von PML RARα wurde zweitens durch die Assoziation des Fusionsproteins mit dem N-CoR-SMRT-Sin3-Corepressor-Komplex erklärt, was zur Rekrutierung von Histon-Deacetylase (HDAC)-Aktivitäten und zum Fehlen der Transkription von Zielgenen führte (REDNER, 1999 ). Interessanterweise wurde eine ähnliche Rekrutierung von Corepressor-HDAC-Aktivitäten bei anderen Fusionsgen-Leukämien, einschließlich PLZF RARα, AML1 ETO, CBFß MYH11 und akuter TEL AML1-Leukämie, berichtet. In PML RARα APL-Zellen ermöglichen therapeutische Konzentrationen von ATRA die Freisetzung von Corepressor-HDAC-Aktivitäten, Histonacetylierung, Chromatinumbau und Transkription von Zielgenen, die möglicherweise für die terminale granulozytäre Differenzierung verantwortlich sind (REDNER, 1999; DILWORK, 2001). Aus dieser Sicht ist die ATRA-Therapie von APL das erste Beispiel einer gengerichteten Therapie, die spezifisch auf pathogene genetische Anomalien bei einer menschlichen Leukämie abzielt.

In VITRO und in vivo beobachtete Resistenz gegen ATRA-induzierte Differenzierung bei Patienten mit PLZF-RARα-Leukämie wurde mit einer stärkeren Rekrutierung von Corepressor-HDAC-Aktivitäten in dieser APL-Untergruppe im Vergleich zu klassischem PML-RARα-APL in Verbindung gebracht (zwei Corepressor-Bindungsstellen auf PLZF statt einer auf PML). Sehr interessanterweise wurde kürzlich gezeigt, dass PLZF-RARα-Leukämiezellen tatsächlich nicht vollständig resistent gegen Differenzierungsinduktion sind, insbesondere wenn geeignete COSTIMULI verabreicht werden. Erstens können sich diese Zellen in Gegenwart einer höheren ATRA-Konzentration (3 Mikromol statt 1 Mikromol) differenzieren.

Zweitens stellt die Zugabe eines HDAC-Inhibitors (Trichostatin A) die ATRA-Empfindlichkeit bei 1 Mikromol wieder her (KITAMURY 2000).

Drittens kann die G-CSF-Signalgebung diese Zellen dazu zwingen, sich einer terminalen Differenzierung zu unterziehen (JANSEN 2001).

Es wurde auch gezeigt, dass HDAC-Inhibitoren in transgenen Modellen von therapieresistenter akuter Promyelozytenleukämie eine Remission induzieren können (He 2001).

Die Empfindlichkeit von HL60-Zellen, die keine chromosomale Umordnung zeigen, die den RARα-Locus betrifft, gegenüber RA-induzierter Differenzierung kann mit diesen Beobachtungen zusammenhängen. Man kann die Hypothese aufstellen, dass einige unbekannte COSTIMULI, einschließlich Chromatin-Remodeling-Ereignisse, zur RA-Empfindlichkeit von HL60-Zellen beitragen.

Aus therapeutischer Sicht führen diese Beobachtungen dazu, nicht zielgerichtete Transkriptionstherapien zu bewerten, die ATRA mit nicht zielgerichteten HDAC-Inhibitoren und/oder cAMP-Induktoren bei Nicht-APL-Leukämien kombinieren. Unter den bekannten HDAC-Inhibitoren (Trichostatin A, Trapoxin A, Butyrat, Oxamflatin, Depsipeptid und MS 275) wurde Natriumphenylbutyrat erfolgreich in Kombination mit ATRA an einen Patienten mit klinisch ATRA-resistenter APL verabreicht (WARRELL, 1998). Dieser Fallbericht stellt das erste Beispiel einer zielgerichteten Transkriptionstherapie bei einer menschlichen Leukämie dar. Kürzlich wurde gezeigt, dass Valproinsäure (VPA) zur Familie der HDAC-Inhibitoren gehört (PHIEL, 2001). Valproinsäure ist eine kurzkettige Fettsäure, die häufig als Antikonvulsivum und Stimmungsstabilisator verwendet wird.

Die charakteristische Verzögerung der Reaktion auf VPA und sein teratogenes Potenzial führten lange Zeit zu der Annahme, dass es durch Modulation der Genexpression wirkt. Es wurde auch berichtet, dass VPA die AP1-abhängige Transkription aktivieren kann (ASGHARI, 1998; Chen, 1999 1; Yuan, 2001) und bcl 2 hochregulieren kann (Chen, 1999 2). Kürzlich wurde auch gezeigt, dass VPA die Differenzierung von F9-Teratokarzinomzellen induzieren kann, von denen bekannt ist, dass sie auch in Gegenwart von RA oder cAMP differenzieren können (WERLING, 2001). Schließlich könnte VPA neoplastische Zellen für pro-apoptotische Stimuli sensibilisieren, indem es die Glutathion (GSH)-Reduktase hemmt, ein Enzym, das für die Aufrechterhaltung hoher zellulärer Spiegel von reduziertem GSH erforderlich ist (Moog, 1996), oder eine Hemmung des NF-κB-Signalwegs (ICHIYAMA, 2000). Interessanterweise wurde auch gezeigt, dass Lithiumchlorid (ein weiterer Stimmungsstabilisator) synergistisch mit ATRA wirkt, um die terminale Differenzierung von WEHI-3B-Leukämiezellen zu induzieren. Wie bei der Kombination von ATRA und G-CSF beobachtet, schien dieser beobachtete Synergismus mit der Verhinderung des RAR-Proteinverlusts in Zusammenhang zu stehen, der normalerweise unter ATRA-Exposition beobachtet wird (Finch, 2000).

Interessanterweise wurde kürzlich gezeigt, dass VPA als Einzelwirkstoff oder in Kombination mit ATRA verabreicht in der Lage ist, klinische hämatologische Reaktionen bei Patienten zu induzieren, die wegen myelodysplastischer Syndrome behandelt werden (KUENDGEN, 2004). In dieser Studie schien eine Vorbehandlung mit VA für weitere positive Wirkungen von ATRA erforderlich zu sein.

Die Retinsäure :

Retinoide stellen eine große Gruppe von Verbindungen dar, die strukturell mit Vitamin A (Retinol) verwandt sind. Sie wirken durch Bindung an und Aktivierung spezifischer Kernrezeptoren, die die DNA binden. Retinsäure (RA), das natürliche Säurederivat von Retinol, ist ein entscheidender Differenzierungsfaktor, der an bestimmten Phasen der Embryonalentwicklung, der Differenzierung des visuellen Systems und (hier von Interesse) der hämopoetischen Granulozytenreifung beteiligt ist (CORNIC, 1994). In VITRO wurde gezeigt, dass RA in der Lage ist, eine granulozytäre Differenzierung der HL60-Zelllinie zu induzieren. Diese Zelllinie wurde 1977 von einem Patienten mit AML etabliert. Die Zellen ähneln weitgehend Promyelozyten, können aber zur terminalen Differenzierung induziert werden. Einige Reagenzien, einschließlich RA, bewirken, dass sich HL60-Zellen zu Granulozyten-ähnlichen Zellen differenzieren, andere zu Monozyten-/Makrophagen-ähnlichen Zellen. Das HL60-Zellgenom enthält ein amplifiziertes c-myc-Protoonkogen, und die c-myc-mRNA-Spiegel nehmen nach Induktion der Differenzierung schnell ab (BIRNIE, 1988).

Wiederkehrende Veränderungen des Gens, das für den RA-Alpha-Rezeptor (RARα, auf Chromosom 17q12 lokalisiert) kodiert, sind mit einigen Untergruppen der akuten myeloischen Leukämie (AML) assoziiert. Die häufigste RARα-Genveränderung ist die reziproke t(15;17)-Chromosomentranslokation, die bei der überwiegenden Mehrheit der akuten Promyelozytenleukämie (APL) beobachtet wird, die der AML-M3-Untergruppe der French-American-British (FAB)-Klassifikation entspricht. Diese Translokation fusioniert das RARα-Gen mit dem PML-Gen (auf Chromosom 15q21 lokalisiert), was zu PML-RARα-Fusionsprodukten führt. Variantentranslokationen, die das RARα-Gen mit anderen Partnern fusionieren, einschließlich PLZF auf Chromosom 11, NPM auf Chromosom 5, NuMA auf Chromosom 11 und STAT5 auf Chromosom 17, wurden selten oder gelegentlich berichtet. Die kausale Rolle der RARα-Fusionsproteine ​​(mindestens PML-RARα und PLZF-RARα) bei APL wurde in Mausmodellen nachgewiesen (KOGAN, 1999). Es wurde gezeigt, dass diese Fusionsproteine ​​in APL-Zellen als dominanter Transkriptionsrepressor wirken können (Melnick, 1999).

Die NB4-Zelllinie wurde 1991 von einem Patienten mit APL etabliert (LANOTTE, 1991). Diese Zelllinie wurde häufig verwendet, um die Biologie dieser Krankheit zu untersuchen. Im Gegensatz zu HL60 trägt NB4 die t(15;17)-Translokation. Wie in HL60-Zellen ist RA in der Lage, eine granulozytische Differenzierung von NB4-Zellen zu induzieren, was durch terminale Induktion von Apoptose zum Zelltod führt. Diese differenzierenden Wirkungen wurden in vivo unter Verwendung verschiedener muriner APL-Modelle bestätigt (KOGAN, 1999; He, 1999).

Basierend auf diesen vorklinischen Beobachtungen wurde APL-Patienten erfolgreich orales all-trans-RA (ATRA) verabreicht. Bei Patienten mit rezidivierender APL induziert die Erstlinientherapie mit ATRA (45 mg/m2/Tag) eine In-vivo-Differenzierung von leukämischen Promyelozyten in abnorme Granulozyten, die noch die PML-RARα-Fusion tragen, was zu einer hämatologischen Remission von etwa 90 % und einer molekularen Remission von 20 % führt Raten, bestimmt durch spezifische PML-RARα-RT-PCR-Negativierung (Huang, 1988; CASTAIGNE, 1990; DEGOS, 1995). Dies war das erste Beispiel einer Differenzierungstherapie bei einer menschlichen Leukämie. Leider wurden solche vorteilhaften Wirkungen bei Patienten mit anderen AML-Subtypen nicht beobachtet, wenn sie mit ATRA unter Verwendung ähnlicher Dosierungen und Schemas behandelt wurden. Nach diesen Ergebnissen bei Patienten mit rezidivierender APL wurde ATRA dann in Kombination mit Chemotherapie während der Erstlinienbehandlung von Patienten mit neu diagnostizierter APL evaluiert. Mehrere kontrollierte Studien haben die ATRA-Chemotherapie-Kombination als aktuelle Standardtherapie für neu diagnostizierte APL etabliert. Offensichtlich werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn ATRA und Chemotherapeutika gleichzeitig verabreicht werden.

Andere therapeutische Interventionen könnten in Betracht gezogen werden, um die RA-Empfindlichkeit in RA-resistenten Zellen zu erhöhen. Erklärungen für die RA-Resistenz beinhalten tatsächlich RA-induzierte erhöhte Expression von Cytochrom-P450-Isoformen (CYPs), RA-induzierte erhöhte Expression von zytoplasmatischen RA-bindenden Proteinen Typ II (CRABP-II), Überexpression von P-Glykoprotein (P-gp) und erworbene Mutationen der Ligandenbindungsregion des RARα-Gens. Mittel, die mit dem ATRA-Metabolismus interagieren, wie HIV-1-Protease-Inhibitoren (Indinavir, Ritonavir, Saquinavir), die CYPs und P-gp hemmen und mit ATRA um die CRABP-I-Bindung konkurrieren, könnten die Induktion der Differenzierung in RA-resistenten Zellen (IKEZOE , 2000).