Acido valproico 5-azacitidina e ATRA in AML e MDS ad alto rischio

Demetilazione della cromatina Oltre alla deacetilazione dell'acetilazione dell'istone, l'ipermetilazione del promotore è un altro meccanismo importante e rilevante coinvolto nella regolazione della trascrizione genica (rivisto in Herman, 2003). Il rimodellamento della cromatina potrebbe quindi essere mirato anche utilizzando analoghi nucleosidici, come 5 azacitidina o decitabina, che riattivano la trascrizione genica attraverso la demetilazione del DNA (Silverman, 2001). Recentemente, in studi in VITRO, l'induzione dell'espressione genica da parte di 5 AzaC è stata ottenuta in cellule AML e MDS primarie mediante meccanismi dipendenti e indipendenti dalla metilazione del DNA (SCHMELZ, 2005)

Ancora una volta, AzaC si è dimostrato in grado di indurre risposte ematologiche cliniche in pazienti con MDS. Uno studio controllato condotto dall'US Cancer and Leukemia Group B (CALBG) ha riportato un più alto tasso di risposta, una minore incidenza di trasformazione leucemica e una sopravvivenza prolungata rispetto alla sola terapia di supporto in questi pazienti Silverman, 2002. È in corso un altro studio di fase 3 di conferma.

AzaC, in combinazione con acido valproico, nella linea cellulare leucemica (HL60 e MOLT4, ha dimostrato un'attività sinergica nell'indurre la riespressione genica (riattivazione di p21 CIP1) e un effetto sinergico in termini di inibizione della crescita, induzione dell'apoptosi (Yang H, 2005 ).

Acetilazione dell'istone Numerosi gruppi di ricercatori hanno cercato di chiarire i meccanismi molecolari alla base della differenziazione indotta dall'ATRA nelle cellule NB4, nelle cellule APL fresche, nei topi APL o nei pazienti affetti da APL (Melnick 1999). Uno dei problemi principali era comprendere il ruolo cruciale della proteina di fusione PML RARα nella risposta di differenziazione all'AR. È stato osservato in primo luogo che le concentrazioni terapeutiche di ATRA determinavano la riformazione dei corpi nucleari della PML associata a una scissione della proteina di fusione RARα della PML. La scomparsa di questo prodotto di fusione che funge da regolatore negativo dominante della trascrizione dei geni bersaglio RA ha fornito una spiegazione per la ripetizione del processo di differenziazione. Il ruolo negativo dominante di PML RARα è stato in secondo luogo spiegato dall'associazione della proteina di fusione al complesso corepressore N-CoR-SMRT-Sin3, che porta al reclutamento delle attività dell'istone deacetilasi (HDAC) e alla mancanza di trascrizione dei geni bersaglio (REDNER, 1999 ). È interessante notare che un reclutamento simile di attività HDAC del corepressore è stato riportato in altre leucemie del gene di fusione, tra cui PLZF RARα, AML1 ETO, CBFß MYH11 e leucemia acuta TEL AML1. Nelle cellule PML RARα APL, le concentrazioni terapeutiche di ATRA consentono il rilascio di attività HDAC del corepressore, l'acetilazione dell'istone, il rimodellamento della cromatina e la trascrizione di geni bersaglio potenzialmente responsabili della differenziazione granulocitica terminale (REDNER, 1999; DILWORK, 2001). Da questo punto di vista, la terapia ATRA dell'APL è il primo esempio di una terapia genica mirata che si rivolge specificamente alle anomalie genetiche patogene in una leucemia umana.

In VITRO e in vivo, la resistenza alla differenziazione indotta da ATRA osservata nei pazienti con leucemia PLZF RARα è stata correlata a un reclutamento più potente delle attività HDAC del corepressore in questo sottoinsieme di APL, rispetto alla classica APL PML-RARα (due siti di legame del corepressore su PLZF invece di uno su PML). Molto interessante, è stato recentemente dimostrato che le cellule leucemiche PLZF RARα non sono in realtà completamente resistenti all'induzione della differenziazione, specialmente se vengono forniti COSTIMULI appropriati. In primo luogo, queste cellule possono differenziarsi in presenza di una maggiore concentrazione di ATRA (3 microM invece di 1 microM).

In secondo luogo l'aggiunta di un inibitore dell'HDAC (tricostatina A) ripristina la sensibilità dell'ATRA a 1 microM (KITAMURY 2000).

In terzo luogo, la segnalazione del G CSF può costringere queste cellule a subire una differenziazione terminale (JANSEN 2001).

Gli inibitori dell'HDAC si sono anche dimostrati in grado di indurre la remissione in modelli transgenici di leucemia promielocitica acuta resistente alla terapia (He 2001).

La sensibilità delle cellule HL60, che non mostrano alcun riarrangiamento cromosomico che coinvolge il locus RARα, alla differenziazione indotta da RA può essere correlata a queste osservazioni. Si può ipotizzare che alcuni COSTIMULI sconosciuti, inclusi gli eventi di rimodellamento della cromatina, contribuiscano alla sensibilità RA delle cellule HL60.

Da un punto di vista terapeutico, queste osservazioni portano a valutare terapie trascrizionali non mirate che combinano ATRA con inibitori HDAC non mirati e/o induttori di cAMP nelle leucemie non APL. Tra i noti inibitori dell'HDAC (tricostatina A, trapossina A, butirrato, oxamflatin, depsipeptide e MS 275), il fenilbutirrato di sodio è stato somministrato con successo in combinazione con ATRA a un paziente con LPA clinicamente resistente all'ATRA (WARRELL, 1998). Questo case report rappresenta il primo esempio di una terapia trascrizionale mirata in una leucemia umana. Recentemente è stato dimostrato che l'acido valproico (VPA) appartiene alla famiglia degli inibitori HDAC (PHIEL, 2001). L'acido valproico è un acido grasso a catena corta ampiamente utilizzato come anticonvulsivante e stabilizzatore dell'umore.

Il caratteristico ritardo nella risposta al VPA e il suo potenziale teratogeno avevano portato a lungo alla proposta che agisse attraverso la modulazione dell'espressione genica. È stato anche riportato che VPA può attivare la trascrizione AP1-dipendente (ASGHARI, 1998; Chen, 1999 1; Yuan, 2001) e sovraregolare bcl 2 (Chen, 1999 2). Recentemente è stato anche dimostrato che il VPA è in grado di indurre la differenziazione delle cellule di teratocarcinoma F9, che sono note per essere anche in grado di differenziarsi in presenza di RA o cAMP (WERLING, 2001). Infine, il VPA potrebbe sensibilizzare le cellule neoplastiche a stimoli pro apoptotici attraverso un'inibizione della glutatione (GSH) reduttasi, un enzima necessario per mantenere alti livelli cellulari di GSH ridotto (Moog, 1996), o un'inibizione della via NF-κB (ICHIYAMA, 2000). È interessante notare che è stato anche dimostrato che il cloruro di litio (un altro stabilizzatore dell'umore) agisce in sinergia con l'ATRA per indurre la differenziazione terminale delle cellule leucemiche WEHI-3B. Come osservato con la combinazione di ATRA e G CSF, questo sinergismo osservato sembrava essere correlato alla prevenzione della perdita di proteine ​​RAR solitamente osservata durante l'esposizione ad ATRA (Finch, 2000).

Di interesse, VPA come agente singolo o somministrato in combinazione con ATRA è stato recentemente dimostrato in grado di indurre risposte ematologiche cliniche in pazienti trattati per sindromi mielodisplastiche (KUENDGEN, 2004). In questo studio, sembrava necessario un pretrattamento con VA per ulteriori effetti positivi di ATRA.

Acido retinoico :

I retinoidi rappresentano un ampio gruppo di composti strutturalmente correlati alla vitamina A (retinolo). Agiscono legandosi e attivando specifici recettori nucleari, che legano il DNA. L'acido retinoico (RA), il derivato acido naturale del retinolo, è un fattore di differenziazione chiave coinvolto in fasi specifiche dello sviluppo embrionale, differenziazione del sistema visivo e (di interesse qui) maturazione granulocitica emopoietica (CORNIC, 1994). In VITRO, l'AR è stato dimostrato in grado di indurre la differenziazione granulocitica della linea cellulare HL60. Questa linea cellulare è stata istituita nel 1977 da un paziente con AML. Le cellule assomigliano in gran parte ai promielociti ma possono essere indotte a differenziarsi in modo terminale. Alcuni reagenti, incluso l'AR, fanno differenziare le cellule HL60 in cellule simili ai granulociti, altre in cellule simili a monociti/macrofagi. Il genoma cellulare HL60 contiene un proto-oncogene c-myc amplificato e i livelli di mRNA di c-myc diminuiscono rapidamente dopo l'induzione della differenziazione (BIRNIE, 1988).

Alterazioni ricorrenti del gene che codifica per il recettore RA alfa (RARα, localizzato sul cromosoma 17q12) sono associate ad alcuni sottoinsiemi di leucemia mieloide acuta (AML). L'alterazione del gene RARα più comune è la traslocazione cromosomica reciproca t(15;17) osservata nella stragrande maggioranza della leucemia promielocitica acuta (APL) corrispondente al sottogruppo AML-M3 della classificazione franco-americana-britannica (FAB). Questa traslocazione fonde il gene RARα con il gene PML (localizzato sul cromosoma 15q21), risultando nei prodotti di fusione PML-RARα. Traslocazioni varianti che fondono il gene RARα con altri partner, tra cui PLZF sul cromosoma 11, NPM sul cromosoma 5, NuMA sul cromosoma 11 e STAT5 sul cromosoma 17, sono state riportate raramente o occasionalmente. Il ruolo causale delle proteine ​​di fusione RARα (almeno PML-RARα e PLZF-RARα) nell'APL è stato dimostrato in modelli murini (KOGAN, 1999). È stato dimostrato che queste proteine ​​di fusione possono agire come un repressore trascrizionale dominante nelle cellule APL (Melnick, 1999).

La linea cellulare NB4 è stata istituita nel 1991 da un paziente con APL (LANOTTE, 1991). Questa linea cellulare è stata ampiamente utilizzata per studiare la biologia di questa malattia. Al contrario di HL60, NB4 porta la traslocazione t(15;17). Come nelle cellule HL60, RA è in grado di indurre la differenziazione granulocitica delle cellule NB4 portando alla morte cellulare attraverso l'induzione terminale dell'apoptosi. Questi effetti differenzianti sono stati confermati in vivo utilizzando diversi modelli murini di APL (KOGAN, 1999; He, 1999).

Sulla base di queste osservazioni precliniche, l'AR all trans orale (ATRA) è stato somministrato con successo a pazienti affetti da APL. Nei pazienti con LPA recidivante, la terapia di prima linea con ATRA (45 mg/m2/die) induce in vivo la differenziazione dei promielociti leucemici in granulociti anomali che ancora portano la fusione PML-RARα, determinando circa il 90% di remissione ematologica e il 20% di remissione molecolare tassi valutati dalla specifica negativazione PML-RARα RT-PCR (Huang, 1988; CASTAIGNE, 1990; DEGOS, 1995). Questo ha rappresentato il primo esempio di una terapia di differenziazione in una leucemia umana. Sfortunatamente, tali effetti benefici non sono stati osservati in pazienti con altri sottotipi di AML quando trattati con ATRA utilizzando un dosaggio e un programma simili. A seguito di questi risultati ottenuti nei pazienti con LPA recidivante, l'ATRA è stato quindi valutato in combinazione con la chemioterapia durante il trattamento di prima linea dei pazienti con LPA di nuova diagnosi. Diversi studi controllati hanno stabilito che la combinazione ATRA-chemioterapia è l'attuale terapia standard per la LPA di nuova diagnosi. Apparentemente, i migliori risultati si ottengono quando ATRA e agenti chemioterapici vengono somministrati contemporaneamente.

Potrebbero essere presi in considerazione altri interventi terapeutici per aumentare la sensibilità all'AR nelle cellule resistenti all'AR. In realtà, le spiegazioni per la resistenza all'AR includono una maggiore espressione indotta da RA delle isoforme del citocromo P450 (CYP), una maggiore espressione indotta da RA delle proteine ​​​​leganti RA citoplasmatiche di tipo II (CRABP-II), la sovraespressione della glicoproteina P (P-gp) e mutazioni acquisite della regione legante il ligando del gene RARα. Gli agenti che interagiscono con il metabolismo dell'ATRA, come gli inibitori della proteasi dell'HIV-1 (indinavir, ritonavir, saquinavir) che inibiscono CYP e P-gp e competono con l'ATRA per il legame CRABP-I, potrebbero migliorare l'induzione della differenziazione nelle cellule RA-resistenti (IKEZOE , 2000).