Periferní krevní kmenové buňky získané od normálních dobrovolníků pro studium retrovirového vektoru zprostředkovaného genového transferu do primitivních hematopoetických buněk a vektorem zprostředkované exprese transgenu ve zralých hematopoetických liniích

Periferní krev byla zavedena jako zdroj krvetvorných kmenových buněk, které poskytují alternativní zdroj kostní dřeně pro hematopoetickou rekonstituci pacientů s onkologickými, hematologickými a genetickými onemocněními. Ačkoli je aferéza méně účinná než odběr kostní dřeně pro odběr velkého množství buněk CD34+ (marker časných hematopoetických prekurzorů), aferéza je méně traumatická, nevyžaduje žádnou anestezii a lze ji provádět častěji než odběr kostní dřeně. Účelem tohoto preklinického výzkumného projektu je prozkoumat použití hematopoetických kmenových buněk mobilizovaných do periferní krve jako cílů pro genovou terapii zprostředkovanou retroviry, porovnat účinnost transdukce primitivních buněk s lentivirovými a pěnovými virovými vektorovými systémy a vyhodnotit schopnost expandovat tyto kmenové buňky ex vivo pomocí hematopoetických růstových faktorů (cytokinů). Účastníky výzkumu v této studii budou zdraví dospělí dobrovolníci.

Růstový faktor, Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF), bude podáván po dobu 4 dnů před aferézou k mobilizaci zvýšeného počtu primitivních hematopoetických buněk z kostní dřeně do oběhu. Buňky s jádry budou odebrány aferézou a buněčná populace obohacená o CD34+ byla izolována pomocí technik na bázi protilátek.

Podávání G-CSF je nezbytné pro umožnění odběru dostatečného počtu primitivních kmenových a progenitorových buněk od normálních dobrovolníků. V dávce, která má být použita v této studii, dochází v periferní krvi k 15-35násobnému zvýšení koncentrace CD34+ buněk během 4 dnů podávání G-CSF, což vede k produktu aferézy, který obsahuje v průměru asi 1-2 x1010 jaderných buněk, ze kterých lze získat 1-2x108 purifikovaných CD34+ buněk. Tento počet je dostatečný pro umožnění experimentálního návrhu, který zahrnuje in vitro kultivaci, transdukci vektorovými částicemi a test transdukovaných buněk v imunodeficientním myším modelu.

Použití G-CSF pro mobilizaci kmenových a progenitorových buněk je široce používaná klinická technika pro autologní i alogenní transplantaci, která se ukázala jako bezpečná a účinná. Bolest kostí a svalů, bolest hlavy a únava jsou nejčastější komplikace, které se obvykle léčí acetaminofenem a zřídka vyžadují přerušení G-CSF. Běžné je přechodné zvýšení alkalické fosfatázy a LDH. Následné studie prokázaly prodlouženou mírnou neutropenii, lymfopenii a trombocytopenii po podání G-CSF a aferéze. Zvětšení sleziny bylo prokázáno neinvazivním měřením a byly popsány čtyři případy ruptury sleziny u normálních jedinců. Bylo hlášeno snížení arteriálního pO2 spojené se snížením saturace O2 z 98 na 96 %. Přechodná trombofilie byla odvozena na základě změn parametrů krevní koagulace.

Byly hlášeny další vzácné komplikace včetně rozvoje zánětlivých nebo infekčních lézí. K fatální krizi došlo u sourozeneckého dárce pro alogenní transplantaci, který měl hemoglobinové SC onemocnění. Tyto vzácné komplikace je třeba dát do kontextu, že podávání G-CSF s následnou aferézou k získání primitivních hematopoetických buněk od normálních jedinců se používá ve všech velkých transplantačních centrech již více než deset let a je obecně bezpečné a bez významných komplikací. Navrhujeme minimalizovat riziko závažných komplikací omezením věkového rozmezí účastníků výzkumu na 18–40 let a vyloučením těch, kteří mají v anamnéze zánětlivé onemocnění, kardiovaskulární onemocnění, trombózu nebo plicní embolizaci, zánětlivá kožní onemocnění, hematologické onemocnění nebo hemoglobinopatii.

Schopnost expandovat mobilizované CD34+ buňky in vitro za použití různých kombinací cytokinů a kultivačních podmínek bude zkoumána pomocí průtokové cytometrie, in vitro koloniových testů a kvantifikací koncentrace buněk, které jsou schopny nastolit hematopoézu u imunodeficientních myší. Jak neexpandované, tak expandované CD34+ buňky budou použity v experimentech navržených ke zkoumání jejich vhodnosti jako cílů pro přenos genů zprostředkovaný retroviry. Účinnost přenosu genu a funkční exprese přenesených sekvencí bude hodnocena v diferencovaném potomstvu buněk CD34+.

Plánujeme porovnat vektorový systém lentivirového a pěnivého viru s ohledem na relativní účinnost genového přenosu do primitivních lidských hematopoetických buněk. Různé látky, např. Fibroblast Growth Factor -1 a Wnt 3A, o kterých bylo hlášeno, že způsobují expanzi primitivních myších hematopoetických buněk, budou také hodnoceny z hlediska jejich účinků na primitivní lidské hematopoetické buňky v kultuře. Dalším zaměřením je srovnání různých globinových genových vektorů s ohledem na relativní úrovně exprese globinového genu v diferencujících erytroidních buňkách. Nakonec bude posouzen vliv kryokonzervace na životaschopnost a potenciál přihojení primitivních hematopoetických buněk. Tento výzkumný návrh poskytne preklinická data, která pomohou při vývoji strategií léčby genetických onemocnění, konkrétně poruch hemoglobinu, založených na přenosu genů do repopulačních kmenových buněk.