Cellules souches du sang périphérique obtenues à partir de volontaires normaux pour étudier le transfert de gènes à médiation vectorielle rétrovirale dans des cellules hématopoïétiques primitives et l'expression transgénique à médiation vectorielle dans des lignées hématopoïétiques matures

Le sang périphérique a été établi comme une source de cellules souches hématopoïétiques, fournissant une source alternative à la moelle osseuse pour la reconstitution hématopoïétique des patients atteints de maladies oncologiques, hématologiques et génétiques. Bien que l'aphérèse soit moins efficace que le prélèvement de moelle osseuse pour la collecte d'un grand nombre de cellules CD34+ (un marqueur des précurseurs hématopoïétiques précoces), l'aphérèse est moins traumatisante, ne nécessite aucune anesthésie et peut être effectuée plus fréquemment que le prélèvement de moelle osseuse. Le but de ce projet de recherche préclinique est d'étudier l'utilisation de cellules souches hématopoïétiques mobilisées dans le sang périphérique comme cibles pour la thérapie génique à médiation rétrovirale, de comparer l'efficacité de la transduction des cellules primitives avec les systèmes de vecteurs lentiviraux et viraux mousseux et d'évaluer la capacité à développer ces cellules souches ex vivo en utilisant des facteurs de croissance hématopoïétiques (cytokines). Les participants à la recherche dans cette étude seront des volontaires adultes en bonne santé.

Le facteur de croissance, Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF), sera administré pendant 4 jours avant l'aphérèse pour mobiliser un nombre accru de cellules hématopoïétiques primitives de la moelle osseuse dans la circulation. Les cellules sanguines nucléées seront collectées par aphérèse et une population cellulaire enrichie en CD34+ sera isolée à l'aide de techniques basées sur les anticorps.

L'administration de G-CSF est essentielle pour permettre la collecte d'un nombre suffisant de cellules souches et progénitrices primitives de volontaires normaux. À la dose à utiliser dans cette étude, une augmentation de 15 à 35 fois de la concentration de cellules CD34+ se produit dans le sang périphérique au cours des 4 jours d'administration de G-CSF, ce qui donne un produit d'aphérèse qui contient, en moyenne, environ 1 à 2 x1010 cellules nucléées à partir desquelles 1-2x108 cellules CD34+ purifiées peuvent être récupérées. Ce nombre est suffisant pour permettre une conception expérimentale qui comprend la culture in vitro, la transduction avec des particules de vecteur et le dosage des cellules transduites dans le modèle de souris immunodéficiente.

L'utilisation du G-CSF pour la mobilisation des cellules souches et progénitrices est une technique clinique largement utilisée pour la transplantation autologue et allogénique qui s'est avérée à la fois sûre et efficace. Les douleurs osseuses et musculaires, les maux de tête et la fatigue sont les complications les plus courantes qui sont généralement prises en charge avec de l'acétaminophène et nécessitent rarement l'arrêt du G-CSF. Des élévations transitoires de la phosphatase alcaline et de la LDH sont fréquentes. Des études de suivi ont montré une neutropénie, une lymphopénie et une thrombocytopénie légères et prolongées après l'administration de G-CSF et l'aphérèse. L'hypertrophie splénique a été démontrée par des mesures non invasives et quatre cas de rupture splénique chez des individus normaux ont été décrits. Une diminution de la pO2 artérielle associée à une diminution de la saturation en O2 de 98 à 96 % a été rapportée. Une thrombophilie transitoire a été déduite sur la base de modifications des paramètres de coagulation sanguine.

D'autres complications rares ont été rapportées dont le développement de lésions inflammatoires ou infectieuses. Une crise mortelle s'est produite chez un frère donneur pour une greffe allogénique qui avait une maladie de l'hémoglobine SC. Ces complications rares doivent être replacées dans le contexte où l'administration de G-CSF suivie d'une aphérèse pour récupérer les cellules hématopoïétiques primitives d'individus normaux a été utilisée dans tous les principaux centres de transplantation pendant plus d'une décennie et a généralement été sûre et sans complications importantes. Nous proposons de minimiser le risque de complications graves en limitant la tranche d'âge des participants à la recherche à 18-40 ans et en excluant ceux ayant des antécédents de maladie inflammatoire, de maladie cardiovasculaire, de thrombose ou d'embolisation pulmonaire, de troubles cutanés inflammatoires, de maladie hématologique ou d'hémoglobinopathie.

La capacité d'étendre les cellules CD34+ mobilisées in vitro en utilisant diverses combinaisons de cytokines et conditions de culture sera examinée en utilisant la cytométrie en flux, des tests de colonies in vitro et en quantifiant la concentration de cellules capables d'établir l'hématopoïèse chez des souris immunodéficientes. Les cellules CD34+ non développées et développées seront utilisées dans des expériences conçues pour étudier leur pertinence en tant que cibles pour le transfert de gènes à médiation rétrovirale. L'efficacité du transfert de gènes et l'expression fonctionnelle des séquences transférées seront évaluées dans la descendance différenciée des cellules CD34+.

Nous prévoyons de comparer les systèmes de vecteurs de virus lentiviraux et spumeux en ce qui concerne l'efficacité relative du transfert de gènes dans les cellules hématopoïétiques humaines primitives. Diverses substances, par exemple, le facteur de croissance des fibroblastes -1 et le Wnt 3A, qui ont été signalées comme provoquant l'expansion des cellules hématopoïétiques murines primitives seront également évaluées pour leurs effets sur les cellules hématopoïétiques humaines primitives en culture. Un autre objectif est la comparaison de divers vecteurs de gènes de globine par rapport aux niveaux relatifs d'expression de gènes de globine dans des cellules érythroïdes en différenciation. Enfin, l'impact de la cryoconservation sur la viabilité et le potentiel de greffe des cellules hématopoïétiques primitives sera évalué. Cette proposition de recherche fournira des données précliniques qui aideront au développement de stratégies de traitement pour les maladies génétiques, en particulier les troubles de l'hémoglobine, basées sur le transfert de gènes dans des cellules souches en repeuplement.