Role mikroRNA při přestavbě orgánů u dysfunkce dolních močových cest

Pozadí

Naléhavost, frekvence a neúplné vyprázdnění jsou klíčové příznaky dysfunkce dolních močových cest (LUT), včetně syndromu bolesti močového měchýře/intersticiální cystitidy (BPS) a syndromu hyperaktivního močového měchýře (OAB). Hyperaktivita detruzoru, která způsobuje příznaky syndromu hyperaktivního močového měchýře, je běžně pozorována u pacientů s obstrukcí výstupu močového měchýře. Dysfunkce LUT je spojena s buněčným stresem, charakterizovaným změnami v buněčné signalizaci a následnými změnami genové exprese vedoucí k přestavbě orgánů. Dříve výzkumníci ukázali, že signalizace zprostředkovaná NK1R byla down-regulována u pacientů s BPS a zapletla mikroRNA (miRNA) do regulace exprese a funkce NK1R.

MikroRNA (miRNA) rychle získávají uznání pro svou roli v mnoha biologických procesech a chorobných stavech. MiRNA jsou endogenní nekódující jednovláknové RNA, které regulují genovou expresi post-transkripčními mechanismy. MikroRNA regulují tisíce lidských genových produktů, což komplikuje úsilí o predikci a funkční ověření jejich cílů. Vzhledem k tomu, že miRNA jsou důležité pro mnoho základních biologických procesů, jakákoli deregulace v jejich biogenezi nebo funkci se může vyvinout do zdravotního stavu. Zde výzkumníci navrhují prozkoumat roli miRNA v genové regulaci během poruch LUT.

Chronický BPS je klinický syndrom charakterizovaný naléhavostí/frekvencí, pánevní bolestí a zánětem v nepřítomnosti detekovatelného agens. Bylo postulováno velké množství patogenetických mechanismů, ale běžně se předpokládá, že se na nich podílí zánětlivá složka. Často bylo zmiňováno poškození epitelu: mucinózní vrstva zdravého močového měchýře je u pacientů s BPS často narušena. Iniciační událost (toxin) může způsobit zvýšenou uroteliální permeabilitu, která následně vede k nervové senzibilizaci. Výsledné poškození buněk se šíří, což vede k samovolně se udržující zánětlivé reakci.

Urgence je stěžejním příznakem dolních močových cest a také jedním z nejvíce obtěžujících příznaků u mužů trpících benigní hyperplazií prostaty a následnou obstrukcí vývodu močového měchýře (BOO). U žen je OAB dynamická porucha a odhaduje se, že 34 % žen starších 40 let pociťuje významné symptomy ukládání moči. Na rozdíl od BPS pacienti s hyperaktivitou neuvádějí bolest močového měchýře, i když vnímání naléhavosti a vznikajícího nepohodlí se mezi jednotlivci liší. Aby bylo možné usnadnit diagnostiku BPS a její odlišení od DO a nabídnout specifické léčebné režimy pro každou poruchu, je důležité odhalit mechanismy, které stojí za patofyziologií těchto onemocnění.

Předchozí výsledky výzkumníků naznačují, že chorobný stav lidského močového měchýře je doprovázen strukturálními a funkčními změnami hladkého svalstva a urotelu. U ucpaných měchýřů je adaptivní reakce orgánu často doprovázena nahrazením kontraktilních proteinů hladkého svalstva jejich nesvalovými nebo embryonálními izoformami. Na druhé straně nepřetržité vystavení neurotransmiterům a nízkému pH během zánětu u BPS indukuje významnou down-regulaci tachykininových receptorů a proteinů těsného spojení, což může být zprostředkováno up-regulovanými miRNA.

Výzkumníci navrhují stanovit individuální vzorce genové exprese charakteristické pro BPS a hyperaktivní i kontrakční měchýře a určit společné mechanismy odpovědí na buněčný stres. Budou studovat roli miRNA v regulaci receptorem zprostředkované signalizace, kontraktility a integrity epitelu u těchto dysfunkcí LUT a vymezí druhy miRNA, charakteristické pro každý symptomatický komplex. Na základě těchto informací identifikují a funkčně ověří genové cíle miRNA v močových měchýřích, aby podpořili vývoj přizpůsobených terapií. Porovnáním exprese regulačních miRNA v hyperaktivních a akontraktilních měchýřích výzkumníci vymezí faktory ovlivňující přechod mezi dvěma programy. Pomocí ověřených cílových párů miRNA/mRNA v buněčných modelech urotelu a hladkého svalstva močového měchýře budou zkoumat, jak přetrvávající stresem indukovaná signalizace během onemocnění ovlivňuje expresi miRNA a funkci jejich cílových proteinů. Poznatky rozšíří znalosti o molekulárních mechanismech dysfunkce LUT a budou mít důsledky pro diagnostiku a léčbu těchto poruch.

Výběr pacienta a zpracování vzorku:

Podle mezinárodních směrnic a terminologie ICS budou definovány čtyři studijní skupiny: kontroly, BPS, hyperaktivní a kontrakční. Na základě klinických nálezů (mezinárodní skóre symptomů prostaty (IPSS), deník močového měchýře za 48 hodin, O'Leary-Santův dotazník a vizuální analogová stupnice bolesti) bude vybráno dvacet klinicky stabilních pacientů pro studijní skupinu. Biopsie budou získány buď v celkové nebo spinální anestezii transuretrálně z kopule močového měchýře pomocí bioptického kleště. Biopsie budou poté rychle zmrazeny v tekutém dusíku nebo ponořeny do RNAlater (Qiagen). Všichni pacienti podstoupí operaci nezávisle na této studii. Tkáň z kopule močového měchýře pro primární buněčné kultury bude získána od pacientů podstupujících cystektomii nebo augmentaci močového měchýře pro dysfunkci močového měchýře jako poslední terapeutickou možnost poté, co jiné méně invazivní terapeutické možnosti selhaly. Kontrolní tkáň bude získána od pacientů s rakovinou močového měchýře, kteří kromě hematurie nemají žádné příznaky dolních močových cest. RNA bude extrahována a úrovně exprese vybraných genů analyzovány pomocí Taqman realtime PCR a genových expresních čipů (Applied Biosystems). Zobrazování vápníku bude použito k monitorování aktivace receptoru a hladin proteinů analyzovaných pomocí SDS-PAGE a Western blottingu. Distribuce v receptorové tkáni bude analyzována imunocytochemicky.

Objektivní

Identifikovat a funkčně ověřit genové cíle miRNA v močovém měchýři s cílem podpořit vývoj přizpůsobených terapií. Porovnáním exprese regulačních miRNA v hyperaktivních a akontraktilních měchýřích výzkumníci vymezí faktory ovlivňující přechod mezi dvěma programy. Pomocí ověřených cílových párů miRNA/mRNA v buněčných modelech urotelu a hladkého svalstva močového měchýře budou zkoumat, jak přetrvávající stresem indukovaná signalizace během onemocnění ovlivňuje expresi miRNA a funkci jejich cílových proteinů. Poznatky rozšíří znalosti o molekulárních mechanismech dysfunkce LUT a budou mít důsledky pro diagnostiku a léčbu těchto poruch.

Metody

RNA bude extrahována a úrovně exprese vybraných genů analyzovány pomocí Taqman realtime PCR a genových expresních čipů (Applied Biosystems). Zobrazování vápníku bude použito k monitorování aktivace receptoru a hladin proteinů analyzovaných pomocí SDS-PAGE a Western blottingu. Distribuce v receptorové tkáni bude analyzována imunocytochemicky.