MikroRNA:iden rooli elinten uudelleenmuodostumisessa alempien virtsateiden toimintahäiriöissä

Tausta

Kiireellisyys, tiheys ja epätäydellinen tyhjennys ovat alempien virtsateiden (LUT) toimintahäiriön, mukaan lukien virtsarakon kipuoireyhtymän/interstitiaalinen kystiitti (BPS) ja yliaktiivisen virtsarakon oireyhtymän (OAB) avainoireita. Virtsarakon yliaktiivisuutta, joka aiheuttaa yliaktiivisen rakon oireyhtymän oireita, havaitaan yleisesti potilailla, joilla on virtsarakon ulostulotukkeuma. LUT:n toimintahäiriö liittyy solustressiin, jolle ovat ominaisia ​​muutokset solujen signaloinnissa ja niistä johtuvat muutokset geenin ilmentymisessä, jotka johtavat elinten uusiutumiseen. Aiemmin tutkijat osoittivat, että NK1R-välitteinen signalointi oli heikosti säädeltyä BPS-potilailla ja osallisena mikroRNA:t (miRNA:t) NK1R:n ilmentymisen ja toiminnan säätelyssä.

MikroRNA:t (miRNA:t) saavat nopeasti tunnustusta roolistaan ​​monissa biologisissa prosesseissa ja sairaustiloissa. MiRNA:t ovat endogeenisiä ei-koodaavia yksijuosteisia RNA:ita, jotka säätelevät geenin ilmentymistä transkription jälkeisillä mekanismeilla. MikroRNA:t säätelevät tuhansia ihmisen geenituotteita, mikä vaikeuttaa pyrkimyksiä ennustaa ja toiminnallisesti validoida niiden kohteet. Koska miRNA:t ovat tärkeitä monille biologisille perusprosesseille, mikä tahansa niiden biogeneesin tai toiminnan deregulaatio voi kehittyä lääketieteelliseksi tilaksi. Tässä tutkijat ehdottavat miRNA:iden roolin tutkimista geenisäätelyssä LUT-häiriöiden aikana.

Krooninen BPS on kliininen oireyhtymä, jolle on tunnusomaista kiireellisyys/frekvenssi, lantion kipu ja tulehdus havaittavissa olevan aineen puuttuessa. Useita patogeneettisiä mekanismeja on oletettu, mutta tulehduskomponentin uskotaan yleisesti liittyvän. Usein on vedottu epiteelivaurioihin: terveen virtsarakon limakalvo on usein vaarassa potilailla, joilla on BPS. Alkutapahtuma (toksiini) voi aiheuttaa lisääntynyttä uroteelin läpäisevyyttä, mikä puolestaan ​​johtaa hermojen herkistymiseen. Tuloksena oleva soluvaurio leviää, mikä johtaa itsestään jatkuvaan tulehdusreaktioon.

Kiireellisyys on alempien virtsateiden keskeinen oire ja myös yksi kiusallisimmista oireista miehillä, jotka kärsivät hyvänlaatuisesta eturauhasen liikakasvusta ja siitä johtuvasta virtsarakon ulostulotukosta (BOO). Naisilla OAB on dynaaminen häiriö, ja arviolta 34 % yli 40-vuotiaista naisista kokee merkittäviä virtsan kertymisen oireita. Toisin kuin BPS, yliaktiiviset potilaat eivät ilmoita virtsarakon kipua, vaikka käsitys kiireellisyydestä ja ilmenevästä epämukavuudesta vaihtelee yksilöiden välillä. BPS:n diagnosoinnin helpottamiseksi ja sen erottamiseksi DO:sta ja erityisten hoito-ohjelmien tarjoamiseksi jokaiselle häiriölle on tärkeää selvittää näiden sairauksien patofysiologian taustalla olevat mekanismit.

Tutkijoiden aikaisemmat tulokset viittaavat siihen, että ihmisen virtsarakon sairas tila liittyy rakenteellisiin ja toiminnallisiin muutoksiin sileässä lihaksessa ja uroteelissä. Tukkeutuneissa rakoissa elimen mukautuvaan vasteeseen liittyy usein sileän lihaksen supistuvien proteiinien korvaaminen niiden ei-lihas- tai alkionisoformeilla. Toisaalta jatkuva altistuminen välittäjäaineille ja alhainen pH BPS:n tulehduksen aikana indusoi takykiniinireseptorien ja tiiviiden liitosproteiinien merkittävää alasäätelyä, mikä saattaa johtua ylöspäin säädellyistä miRNA:ista.

Tutkijat ehdottavat BPS:lle ja yliaktiivisille sekä supistuville rakkoille ominaisten yksittäisten geenien ilmentymismallien selvittämistä ja solun stressireaktioiden yhteisten mekanismien selvittämistä. He tutkivat miRNA:iden roolia reseptorivälitteisen signaloinnin, supistumisen ja epiteelin eheyden säätelyssä näissä LUT-häiriöissä ja määrittelevät miRNA-lajit, jotka ovat tyypillisiä kullekin oireelliselle kompleksille. Tämän tiedon perusteella he tunnistavat ja toiminnallisesti validoivat miRNA:iden geenikohteet virtsarakoissa edistääkseen räätälöityjen hoitojen kehittämistä. Vertaamalla säätelevien miRNA:iden ilmentymistä yliaktiivisissa ja supistuvissa rakoissa tutkijat määrittelevät tekijät, jotka vaikuttavat vaihtoon näiden kahden ohjelman välillä. Käyttämällä validoituja miRNA/mRNA-kohdepareja solupohjaisissa uroteelin ja virtsarakon sileän lihaksen malleissa he tutkivat, kuinka jatkuva stressin aiheuttama signalointi sairauden aikana vaikuttaa miRNA:n ilmentymiseen ja kohdeproteiinien toimintaan. Löydökset laajentavat tietoa LUT:n toimintahäiriön molekyylimekanismeista ja vaikuttavat näiden häiriöiden diagnosointiin ja hoitoon.

Potilaan valinta ja näytteen käsittely:

Kansainvälisten ohjeiden ja ICS-terminologian mukaisesti määritellään neljä opintoryhmää: kontrollit, BPS, yliaktiivinen ja supistunut. Kaksikymmentä kliinisesti vakaata potilasta pro tutkimusryhmää rekrytoidaan kliinisten löydösten perusteella (kansainvälinen eturauhasoireiden pistemäärä (IPSS), virtsarakon päiväkirja yli 48 tunnin ajalta, O'Leary-Sant-kysely ja visuaalinen analoginen kivun asteikko). Biopsiat otetaan joko yleis- tai spinaalipuudutuksessa transuretraalisesti virtsarakon kupusta biopsiapihdillä. Biopsiat jäädytetään sitten nestetypessä tai upotetaan RNAlateriin (Qiagen). Kaikille potilaille tehdään leikkaus tästä tutkimuksesta riippumatta. Kudosta virtsarakon kupusta primaarisoluviljelmiä varten saadaan potilailta, joille tehdään rakon poisto tai virtsarakon lisäys virtsarakon toimintahäiriön vuoksi viimeisenä hoitovaihtoehtona sen jälkeen, kun muut vähemmän invasiiviset hoitovaihtoehdot ovat epäonnistuneet. Kontrollikudosta saadaan virtsarakon syöpäpotilailta, joilla ei ole alempien virtsateiden oireita hematuriaa lukuun ottamatta. RNA uutetaan ja valittujen geenien ilmentymistasot analysoidaan käyttämällä Taqmanin reaaliaikaista PCR:ää ja geeniekspressiojärjestelmää (Applied Biosystems). Kalsiumkuvausta käytetään SDS-PAGE:lla ja Western Blottingilla analysoitujen reseptoriaktivaatioiden ja proteiinitasojen seuraamiseen. Reseptorikudoksen jakautuminen analysoidaan immunosytokemialla.

Tavoite

Tunnistaa ja toiminnallisesti validoida miRNA:iden geenikohteet virtsarakossa räätälöityjen hoitojen kehittämisen edistämiseksi. Vertaamalla säätelevien miRNA:iden ilmentymistä yliaktiivisissa ja supistuvissa rakoissa tutkijat määrittelevät tekijät, jotka vaikuttavat vaihtoon näiden kahden ohjelman välillä. Käyttämällä validoituja miRNA/mRNA-kohdepareja solupohjaisissa uroteelin ja virtsarakon sileän lihaksen malleissa he tutkivat, kuinka jatkuva stressin aiheuttama signalointi sairauden aikana vaikuttaa miRNA:n ilmentymiseen ja kohdeproteiinien toimintaan. Löydökset laajentavat tietoa LUT:n toimintahäiriön molekyylimekanismeista ja vaikuttavat näiden häiriöiden diagnosointiin ja hoitoon.

menetelmät

RNA uutetaan ja valittujen geenien ilmentymistasot analysoidaan käyttämällä Taqmanin reaaliaikaista PCR:ää ja geeniekspressiojärjestelmää (Applied Biosystems). Kalsiumkuvausta käytetään SDS-PAGE:lla ja Western Blottingilla analysoitujen reseptoriaktivaatioiden ja proteiinitasojen seuraamiseen. Reseptorikudoksen jakautuminen analysoidaan immunosytokemialla.