Il ruolo dei microRNA nel rimodellamento degli organi nella disfunzione del tratto urinario inferiore

Sfondo

L'urgenza, la frequenza e lo svuotamento incompleto sono i sintomi chiave della disfunzione del tratto urinario inferiore (LUT), tra cui la sindrome del dolore alla vescica/cistite interstiziale (BPS) e la sindrome della vescica iperattiva (OAB). L'iperattività del detrusore, che causa i sintomi della sindrome della vescica iperattiva, è comunemente osservata nei pazienti con ostruzione dello sbocco vescicale. La disfunzione della LUT è associata allo stress cellulare, caratterizzato da cambiamenti nella segnalazione cellulare e dalle conseguenti alterazioni dell'espressione genica che portano al rimodellamento dell'organo. In precedenza i ricercatori avevano dimostrato che la segnalazione mediata da NK1R era sottoregolata nei pazienti con BPS e implicava microRNA (miRNA) nella regolazione dell'espressione e della funzione di NK1R.

I microRNA (miRNA) stanno rapidamente guadagnando riconoscimento per il loro ruolo in molti processi biologici e stati patologici. I miRNA sono RNA endogeni a singolo filamento non codificanti che regolano l'espressione genica mediante meccanismi post-trascrizionali. I microRNA regolano migliaia di prodotti genici umani, complicando gli sforzi per prevedere e validare funzionalmente i loro bersagli. Poiché i miRNA sono importanti per molti processi biologici di base, qualsiasi deregolamentazione nella loro biogenesi o funzione può trasformarsi in una condizione medica. Qui i ricercatori propongono di indagare sul ruolo dei miRNA nella regolazione genica durante i disturbi LUT.

La BPS cronica è una sindrome clinica caratterizzata da urgenza/frequenza, dolore pelvico e infiammazione in assenza di un agente rilevabile. Sono stati postulati una moltitudine di meccanismi patogenetici, ma si ritiene comunemente che sia coinvolta una componente infiammatoria. Il danno epiteliale è stato spesso invocato: lo strato mucinoso della vescica sana è spesso compromesso nei pazienti con BPS. Un evento iniziale (tossina) può causare un aumento della permeabilità uroteliale, che a sua volta porta alla sensibilizzazione dei nervi. Il conseguente danno cellulare si propaga, portando a una reazione infiammatoria che si autoalimenta.

L'urgenza è un sintomo cardine del tratto urinario inferiore e anche uno dei sintomi più fastidiosi negli uomini che soffrono di iperplasia prostatica benigna e la conseguente ostruzione dello sbocco della vescica (BOO). Nelle donne l'OAB è un disturbo dinamico e si stima che il 34% delle donne sopra i 40 anni manifesti significativi sintomi di accumulo urinario. A differenza della BPS, i pazienti con iperattività non riferiscono dolore alla vescica, sebbene la percezione dell'urgenza e il disagio derivante varino da individuo a individuo. Al fine di facilitare la diagnosi di BPS e la sua distinzione da DO e offrire regimi di trattamento specifici per ciascun disturbo, è importante svelare i meccanismi alla base della fisiopatologia di queste malattie.

I risultati precedenti dei ricercatori suggeriscono che lo stato malato della vescica urinaria umana è concomitante con cambiamenti strutturali e funzionali nella muscolatura liscia e nell'urotelio. Nelle vesciche ostruite, la risposta adattativa dell'organo è spesso accompagnata dalla sostituzione delle proteine ​​contrattili della muscolatura liscia con le loro isoforme non muscolari o embrionali. D'altra parte, una continua esposizione ai neurotrasmettitori e un basso pH durante l'infiammazione nella BPS induce una significativa sottoregolazione dei recettori della tachichinina e delle proteine ​​​​della giunzione stretta, che potrebbero essere mediate dai miRNA sovraregolati.

I ricercatori propongono di stabilire i singoli modelli di espressione genica caratteristici per BPS e vesciche iperattive e acontrattili e determinare i meccanismi comuni delle risposte allo stress cellulare. Studieranno il ruolo dei miRNA nella regolazione della segnalazione mediata dal recettore, della contrattilità e dell'integrità epiteliale in queste disfunzioni LUT, e delineeranno le specie di miRNA, caratteristiche di ciascun complesso sintomatico. Sulla base di queste informazioni, identificheranno e convalideranno funzionalmente i bersagli genici dei miRNA nelle vesciche urinarie al fine di promuovere lo sviluppo di terapie personalizzate. Confrontando l'espressione dei miRNA regolatori nelle vesciche iperattive e acontrattili, i ricercatori delineeranno i fattori che influenzano il passaggio tra i due programmi. Usando coppie target miRNA/mRNA convalidate in modelli cellulari di urotelio e muscolatura liscia della vescica, studieranno come la segnalazione persistente indotta dallo stress durante la malattia influenzi l'espressione e la funzione del miRNA delle loro proteine ​​bersaglio. I risultati amplieranno la conoscenza dei meccanismi molecolari della disfunzione del LUT e avranno implicazioni per la diagnosi e il trattamento di questi disturbi.

Selezione del paziente ed elaborazione del campione:

Quattro gruppi di studio saranno definiti secondo le linee guida internazionali e la terminologia ICS: controlli, BPS, iperattivi e acontrattili. Verranno reclutati venti pazienti clinicamente stabili per gruppo di studio sulla base dei risultati clinici (punteggio internazionale dei sintomi della prostata (IPSS), diario della vescica nell'arco di 48 ore, questionario O'Leary-Sant e scala analogica visiva per il dolore). Le biopsie saranno ottenute in anestesia generale o spinale transuretrale dalla cupola della vescica con una pinza per biopsia. Le biopsie verranno quindi congelate in azoto liquido o immerse in RNAlater (Qiagen). Tutti i pazienti saranno sottoposti a intervento chirurgico indipendentemente da questo studio. Il tessuto dalla cupola della vescica per colture cellulari primarie sarà ottenuto da pazienti sottoposti a cistectomia o aumento della vescica per disfunzione della vescica come ultima opzione terapeutica dopo che altre opzioni terapeutiche meno invasive hanno fallito. Il tessuto di controllo sarà ottenuto da pazienti con cancro alla vescica, che non presentano sintomi del tratto urinario inferiore a parte l'ematuria. L'RNA sarà estratto ei livelli di espressione dei geni selezionati saranno analizzati mediante Taqman realtime PCR e array di espressione genica (Applied Biosystems). L'imaging del calcio sarà utilizzato per monitorare l'attivazione del recettore ei livelli proteici analizzati mediante SDS-PAGE e Western Blotting. La distribuzione tissutale del recettore sarà analizzata mediante immunocitochimica.

Obbiettivo

Identificare e validare funzionalmente bersagli genici dei miRNA nella vescica urinaria al fine di favorire lo sviluppo di terapie personalizzate. Confrontando l'espressione dei miRNA regolatori nelle vesciche iperattive e acontrattili, i ricercatori delineeranno i fattori che influenzano il passaggio tra i due programmi. Usando coppie target miRNA/mRNA convalidate in modelli cellulari di urotelio e muscolatura liscia della vescica, studieranno come la segnalazione persistente indotta dallo stress durante la malattia influenzi l'espressione e la funzione del miRNA delle loro proteine ​​bersaglio. I risultati amplieranno la conoscenza dei meccanismi molecolari della disfunzione del LUT e avranno implicazioni per la diagnosi e il trattamento di questi disturbi.

Metodi

L'RNA sarà estratto ei livelli di espressione dei geni selezionati saranno analizzati mediante Taqman realtime PCR e array di espressione genica (Applied Biosystems). L'imaging del calcio sarà utilizzato per monitorare l'attivazione del recettore ei livelli proteici analizzati mediante SDS-PAGE e Western Blotting. La distribuzione tissutale del recettore sarà analizzata mediante immunocitochimica.