Definování molekulárních a fyziologických mechanismů dysfunkce buněk pankreatických ostrůvků, které vedou k diabetu 2. (DIVA-Exeter)

Úvod:

Ve spolupráci se spolupracovníky v rámci probíhajících genetických studií vyšetřovatelé identifikovali několik genetických variací (změn DNA) spojených s produkcí a zpracováním inzulínu a snaží se pochopit, jak tyto genetické variace způsobují rozdíly ve schopnosti lidí produkovat nebo zpracovávat inzulín. Jejich zjištění povedou k lepšímu pochopení toho, jak slinivka produkuje a zpracovává inzulín po jídle, a pomohou lépe porozumět tomu, proč se u některých lidí rozvine cukrovka a u některých nikoli, a to i přes podobnou úroveň obezity. Tato otázka má velký význam pro veřejné zdraví, protože je nepravděpodobné, že by prevalence obezity v dohledné době dramaticky poklesla.

Vyšetřovatelé by chtěli otestovat hypotézu, že jedinci nesoucí různé genetické variace mají různé schopnosti produkovat nebo zpracovávat inzulín. Budou testovat důsledky těchto genetických variací, když musí slinivka produkovat inzulín v reakci na jídlo nebo složky jídla, jako je cukr nebo aminokyseliny.

Studovat design:

Toto je prospektivní kohortová studie „nábor podle genotypu“, která bude testovat roli několika genetických variant (nebo kombinací variant) po dobu 4 let (od konce roku 2014 do konce roku 2018). Genetické varianty budou vybrány, pokud existuje silný důkaz, že hrají roli ve slinivce břišní a při sekreci inzulínu. Každá genetická varianta bude zahrnovat jinou sadu výzkumných dobrovolníků a trochu jinou sadu testů. Účastníci budou zaslepeni ke stavu své genetické varianty. Některé genetické varianty budou identifikovány během příštích 4 let, takže není možné na začátku definovat podrobnou metodologii pro všechny studované kohorty. Tento protokol byl proto sepsán, aby popsal hlavní protokol relevantní pro celou studii, s přílohami pro popis konkrétních kohort v rámci studie. Vzhledem k tomu, že obecné řízení a etické otázky jsou zastřešující, protože nové genetické varianty jsou identifikovány během 4letého období studie, budou přílohy specifické pro kohorty přidány jako hlavní změny, spíše než předkládání každé kohorty jako samostatné etické žádosti. Postup pro nábor a testování každé skupiny výzkumných dobrovolníků bude stejný s výjimkou komponenty, která bude popsána v přílohách specifických pro kohortu.

Účastníci studie:

Všichni účastníci budou identifikováni ze stávajících výzkumných kohort spravovaných NIHR Exeter Research Facility (Exeter CRF) a/nebo Oxford Biobank (OBB) a nábor bude usnadněn v rámci Exeter CRF a/nebo Oxford Center for Diabetes, Endokrinology and Medicine ( OCDEM). Jednotlivci budou identifikováni s variantou zájmu nebo jako kontroly odpovídající pohlaví, věku a BMI. Všichni potenciální účastníci budou „zaslepeni“ správcem dat, takže studijní tým nebude vědět, kteří účastníci mají variantu a kteří jsou kontroly. Do studie budou pozváni dopisem a budou jim poskytnuty informace o studiu a kontaktní údaje studijního týmu. Člen studijního týmu je bude kontaktovat během 2–3 týdnů, aby zjistil, zda mají zájem o účast, poskytne jim podrobnější vysvětlení toho, co studie obnáší, a ověří jejich způsobilost. Pokud souhlasí s účastí, bude požádán o ústní souhlas s návštěvou nalačno a bude dohodnuta schůzka, která bude potvrzena písemně/e-mailem.

Identifikace genetické variace:

Měření genetických faktorů u těchto jedinců je nepřetržitý proces, který zahrnuje rutinní laboratorní měření s použitím jediného existujícího vzorku DNA, který dobrovolníci poskytli během své účasti v Exeter 10000 Project/OBB. K červnu 2014 bylo v Exeteru naměřeno 94 genetických variant (známých také jako změny DNA) u 5600 dobrovolníků EXTEND a 800 000 genetických variant v podskupině 1700 dobrovolníků EXTEND. V průběhu následujících 4 let budou genetická opatření rozšířena na všechny účastníky (až 10 000) a všechny varianty (800 000+). Tato data budou podle potřeby vrácena do databáze EXTEND/OBB.

Jednotlivci identifikovaní s genetickou variací zájmu budou pozváni k účasti (30-50, v závislosti na souvisejících specifických testech) spolu s podobným počtem kontrolních jedinců stejného pohlaví, věku a BMI bez změny zájmu. Definice shody bude stejné pohlaví, věk +/- 1 rok a BMI v rámci jednotky 1 kgm2, ale tato rozmezí mohou být rozšířena, pokud nebude k dispozici dostatek jedinců v užší definici.

Postup návštěvy:

Všichni účastníci budou požádáni, aby se přes noc postili (od 22 hodin předchozí noci), vyvarovali se namáhavého cvičení a kouření po dobu 24 hodin před ranní návštěvou v Exeter CRF/OCDEM (přibližně 2-4 hodiny v závislosti na výběru testu). Účastníci budou požádáni, aby podepsali písemný souhlas před jakýmkoli sběrem dat nebo testem. Pacienti, kteří nemají schopnost vyjádřit souhlas, nebudou přijati. Účastníci dostanou příležitost kontaktovat člena výzkumného týmu, aby projekt v případě potřeby prodiskutovali podrobněji. Všichni účastníci budou informováni o povaze a účelu studie, jejích požadavcích a možných rizicích a jejich právu kdykoli odstoupit ze studie bez předsudků a bez ohrožení jakékoli budoucí klinické péče.

Všichni účastníci podstoupí základní sběr dat, měření a poskytnou nalačno a stimulované vzorky krve. Kohorta účastníků může být požádána, aby se vrátila na druhou návštěvu a podrobila se dalšímu testu, který poskytne srovnávací opatření. Výběr testu závisí na zkoumané genetické variaci – podrobně uvedeno v přílohách specifických pro kohortu.

Sběr základních dat, měření a vzorky pro všechny účastníky - cca. 1 hodina Antropometrie: budou zaznamenány údaje včetně výšky (m), hmotnosti (kg), pasu (cm) a obvodu boků (cm).

Lékařská anamnéza: včetně aktuálních léků a informací o životním stylu (kouření/alkohol).

BOD POD: Účastníci budou požádáni, aby si nechali změřit tukovou hmotnost pomocí BOD POD. Tato neinvazivní technika poskytuje přesnější měření tukové hmoty ve srovnání s měřením bioimpedence nebo měřením výšky a hmotnosti. Účastníci, kteří se odhlásí z tohoto testu, nebudou ze studie vyloučeni.

Podrobné údaje o složení těla budou získány pomocí systému sledování složení těla. To stručně zahrnuje zařízení BOD POD, elektronické váhy a počítač. Využívá principů tělesné denzitometrie (měření hmotnosti a objemu) k výpočtu procentuálního a absolutního množství tuku a beztukové hmoty účastníka. Účastníci budou požádáni, aby nosili minimálně oblečení (např. plavecký kostým) a přiléhavou plavkovou čepici. Stojí na elektrické váze a zaznamenávají svou hmotnost, která je pak kalibrována pomocí BOD POD. Účastníci jsou požádáni, aby seděli uvnitř BOD POD po dobu až 1 minuty (maximálně 3krát). Počítač pak analyzuje a generuje výsledky.

Vzorky krve:

Malá kanyla (tenká plastová hadička) bude zavedena do žíly podle standardní klinické praxe, aby se minimalizovalo jakékoli potenciální trauma z opakovaného odběru krve.

Vzorky nalačno budou získány pro základní měření (včetně rutinního měření glukózy a lipidů), DNA, plazmy a séra, pro skladování a budoucí dávkovou analýzu včetně měření glukózy a inzulínu a dalších sledovaných markerů.

Od všech účastníků budou odebrány stimulované vzorky krve. Výběr stimulačního činidla bude záviset na konkrétní studované genetické variaci. Na konci zkušebního období bude kanyla odstraněna a účastníkovi bude nabídnuta snídaně/občerstvení.

Definice genotypů zájmu a podrobnosti o návštěvě (návštěvách) jsou uvedeny v přílohách protokolu specifických pro kohortu. Kromě sběru základních dat, měření a vzorků nalačno každá kohorta podstoupí až dva níže popsané testy.

A: Glukózou potencovaná argininem indukovaná sekrece inzulínu (GPAIS) - cca. 1½ hodiny Odůvodnění. Tento test je určen především k testování maximální kapacity sekrece inzulínu beta buněk účastníka. Poskytuje nejlepší dostupnou náhradu hmoty beta buněk, na rozdíl od funkce beta buněk (Kahn 2008), a pomůže tak lépe pochopit mechanismy, jak vybrané genetické varianty ovlivňují riziko diabetu. Nedávno se ukázalo, že dobře koreluje s počtem (autologních) ostrůvků transplantovaných pacientům s pankreatitidou po pankreatektomii. U psů a nehumánních primátů dobře koreluje s % hmoty beta buněk (přehled v Kahn 3). Test je založen na dobře popsaném (Kahn 2008; Larsson & Ahren 1998) principu, že neglukózový sekretagog, jako je aminokyselina arginin, bude produkovat větší inzulínovou odpověď, je-li potencován vysokými hladinami glukózy, přičemž kombinovaný stimul produkuje téměř maximální odpověď beta buněk.

Test GPAIS zahrnuje 5 fází:

1. Založit. Intravenózní katétry budou zavedeny do antekubitálních žil na obou pažích. Jedno rameno bude použito pro infuzi glukózy/aminokyseliny a druhé rameno pro přerušovaný odběr vzorků. Koncentrace glukózy v krvi bude během testu monitorována pravidelnými měřeními YSI.
2. AIRarg (akutní reakce inzulínu na arginin). Základní vzorky budou odebrány v -2 a -0 min. Maximálně stimulující bolusová dávka arginin hydrochloridu (5 g) bude poté aplikována intravenózně po dobu 45 sekund. Vzorky budou odebírány v +2, +3, +4 a +5 min.
3. Akutní inzulínová odpověď na intravenózní glukózu (nevalidovaná míra akutní inzulínové odpovědi na intravenózní glukózu AIRglukózu). Poté bude zahájena vysokorychlostní (900 ml/hod) infuze 20% glukózy po dobu 10-25 minut (celkový objem infuze až 410 ml). Vzorky budou odebírány v -5, -2 min (před zahájením vysokorychlostní infuze) a poté v 2minutových intervalech po dobu 10 minut po zahájení infuze glukózy.
4. AIRMAXarg. Když hladiny glukózy dosáhnou 20 mmol/l (nebo po max. 25 minutách), budou odebrány opakované základní vzorky, infuze glukózy se sníží na 300 ml/h a podá se druhý bolus arginin hydrochloridu (5 g), po kterém následuje konečný + 2, +3, +4 a +5 min vzorky.
5. Obnova a monitorování glukózy a inzulinu, když se hladiny glukózy účastníka vrátí na výchozí hodnotu. Vzorky glukózy a inzulinu budou odebírány každých 10 minut po dobu 50 minut po skončení testu AIRMAXarg, aby bylo možné sledovat zotavení účastníka a poskytnout míru citlivosti na inzulin. Hladina cukru v krvi bude monitorována pravidelnými měřeními YSI, dokud se hladina cukru v krvi účastníka nevrátí na bezpečnou úroveň. Na konci tohoto období obdrží účastník lehký oběd.

Vzorky: ve všech časových bodech bude měřen inzulín a glukóza. Náhradní alikvoty budou uloženy a uloženy při -80 °C pro případnou další analýzu, jako je glukagon a C-peptid.

B: Intravenózní glukózový toleranční test (IGTT aka IVGTT) - cca. 30 minut Odůvodnění. Tento test je uznávaným standardním měřítkem první fáze sekrece inzulinu, která nezahrnuje neurohormonální (inkretin) a absorpční účinky perorálního podání glukózy.

C: Orální test glukózové tolerance (OGTT) - cca. 2,5 hodiny Odůvodnění. Tento test je uznávaným standardním měřítkem sekrece inzulinu a absorpce účinků orálního podání glukózy.

D: Vzorek stolice pro měření elastázy ve stolici Odůvodnění. To bude testovat hypotézu, že genetický polymorfismus může kromě endokrinní funkce pankreatu ovlivnit i exokrinní funkci pankreatu.

Účastník obdrží nádobku na vzorky, předplacenou polstrovanou obálku, přepravní nádobu a pokyny k odběru a odeslání vzorku stolice k analýze. Poskytnutí vzorku stolice bude volitelné a nebude nezbytné pro zařazení do studie.