Zdefiniowanie molekularnych i fizjologicznych mechanizmów dysfunkcji komórek wysp trzustkowych prowadzących do cukrzycy typu 2 (DIVA-Exeter)

Wstęp:

Współpracując ze współpracownikami w ramach trwających badań genetycznych, badacze zidentyfikowali kilka wariacji genetycznych (zmian DNA) związanych z produkcją i przetwarzaniem insuliny i próbują zrozumieć, w jaki sposób te wariacje genetyczne powodują różnice w zdolności ludzi do produkcji lub przetwarzania insuliny. Ich odkrycia doprowadzą do lepszego zrozumienia, w jaki sposób trzustka wytwarza i przetwarza insulinę po posiłku, a także pomogą lepiej zrozumieć, dlaczego niektórzy ludzie zapadają na cukrzycę, a inni nie, pomimo podobnego poziomu otyłości. To pytanie ma ogromne znaczenie dla zdrowia publicznego, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby rozpowszechnienie otyłości drastycznie spadło w dającej się przewidzieć przyszłości.

Badacze chcieliby przetestować hipotezę, że osoby posiadające różne warianty genetyczne mają różne zdolności do produkcji lub przetwarzania insuliny. Przetestują konsekwencje tych zmienności genetycznych, gdy trzustka musi produkować insulinę w odpowiedzi na posiłek lub składniki posiłku, takie jak cukier lub aminokwasy.

Projekt badania:

Jest to prospektywne badanie kohortowe „rekrutacja według genotypu”, które przetestuje rolę kilku wariantów genetycznych (lub kombinacji wariantów) w okresie 4 lat (od końca 2014 r. do końca 2018 r.). Warianty genetyczne zostaną wybrane, jeśli istnieją mocne dowody na to, że odgrywają one rolę w trzustce i wydzielaniu insuliny. Każdy wariant genetyczny będzie obejmował inny zestaw ochotników badawczych i nieco inny zestaw testów. Uczestnicy będą ślepi na swój status wariantu genetycznego. Niektóre warianty genetyczne zostaną zidentyfikowane w ciągu najbliższych 4 lat, więc nie jest możliwe określenie na wstępie szczegółowej metodologii dla wszystkich badanych kohort. Niniejszy protokół został zatem napisany w celu opisania głównego protokołu istotnego dla całego badania, z załącznikami opisującymi określone kohorty w ramach badania. Ponieważ ogólne zarządzanie i kwestie etyczne są nadrzędne, w miarę identyfikowania nowych wariantów genetycznych w ciągu 4-letniego okresu badań, załączniki specyficzne dla kohorty zostaną dodane jako główne poprawki, zamiast składania każdej kohorty jako oddzielnego wniosku etycznego. Procedura rekrutacji i testowania każdego zestawu ochotników badawczych będzie taka sama, z wyjątkiem elementu, który zostanie przedstawiony w załącznikach dotyczących poszczególnych kohort.

Uczestnicy badania:

Wszyscy uczestnicy zostaną zidentyfikowani na podstawie istniejących kohort badawczych zarządzanych przez NIHR Exeter Research Facility (Exeter CRF) i/lub Oxford Biobank (OBB), a rekrutacja będzie ułatwiona w ramach Exeter CRF i/lub Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Medicine ( OCDEM). Osoby zostaną zidentyfikowane za pomocą wariantu zainteresowania lub jako kontrole dopasowane do płci, wieku i BMI. Wszyscy potencjalni uczestnicy zostaną „zaślepieni” przez administratora danych, aby zespół badawczy nie wiedział, którzy uczestnicy mają wariant, a którzy stanowią grupę kontrolną. Zostaną oni zaproszeni do badania listownie i otrzymają arkusz informacyjny badania oraz dane kontaktowe zespołu badawczego. Członek zespołu badawczego skontaktuje się z nimi w ciągu 2-3 tygodni, aby ustalić, czy są zainteresowani udziałem, aby dokładniej wyjaśnić, na czym polega badanie i sprawdzić, czy kwalifikują się. Jeśli wyrażą zgodę na udział w wizycie, zostanie poproszona o ustną zgodę na wizytę na czczo oraz zostanie umówiona i potwierdzona pisemnie/e-mailowo wizyta.

Identyfikacja zmienności genetycznej:

Mierzenie czynników genetycznych u tych osób to ciągły proces, który obejmuje rutynowe pomiary laboratoryjne przy użyciu pojedynczej istniejącej próbki DNA, którą ochotnicy dostarczyli podczas swojego udziału w projekcie Exeter 10000/OBB. Od czerwca 2014 r. W Exeter zmierzono 94 warianty genetyczne (inaczej zmiany DNA) u 5600 ochotników EXTEND i 800 000 wariantów genetycznych w podzbiorze 1700 ochotników EXTEND. W ciągu najbliższych 4 lat środki genetyczne zostaną rozszerzone na wszystkich uczestników (do 10 000) i wszystkie warianty (800 000+). Dane te zostaną w razie potrzeby zwrócone do bazy danych EXTEND/OBB.

Osoby zidentyfikowane z genetyczną zmiennością będą zaproszone do udziału (30-50, w zależności od powiązanych konkretnych testów) wraz z podobną liczbą osób kontrolnych dobranych pod względem płci, wieku i BMI bez zmienności zainteresowań. Definicja dopasowania będzie obejmowała tę samą płeć, wiek +/- 1 rok i BMI w granicach 1 jednostki kgm2, ale zakresy te mogą zostać poszerzone, jeśli w ściślejszej definicji nie będzie wystarczającej liczby osób.

Procedura wizyty:

Wszyscy uczestnicy zostaną poproszeni o poszczenie przez całą noc (od 22:00 poprzedniej nocy), unikanie forsownych ćwiczeń i palenia przez 24 godziny przed poranną wizytą w Exeter CRF/OCDEM (około 2-4 godzin w zależności od wyboru testu). Uczestnicy zostaną poproszeni o podpisanie pisemnej zgody przed jakimkolwiek zbieraniem danych lub badaniem. Pacjenci, którzy nie mają zdolności do wyrażenia zgody, nie będą rekrutowani. W razie potrzeby uczestnicy będą mieli możliwość skontaktowania się z członkiem zespołu badawczego w celu bardziej szczegółowego omówienia projektu. Wszyscy uczestnicy zostaną poinformowani o charakterze i celu badania, jego wymaganiach i możliwych zagrożeniach oraz o prawie do wycofania się z badania w dowolnym momencie bez uszczerbku i bez zagrożenia dla przyszłej opieki klinicznej.

Wszyscy uczestnicy zostaną poddani gromadzeniu podstawowych danych, pomiarom i dostarczą próbki krwi na czczo i po stymulacji. Kohorta uczestników może zostać poproszona o powrót na drugą wizytę w celu poddania się dalszemu testowi w celu uzyskania środków porównawczych. Wybór testu zależy od badanej zmienności genetycznej — szczegółowo opisano w załącznikach dotyczących poszczególnych kohort.

Zbiór podstawowych danych, pomiary i próbki dla wszystkich uczestników – ok. 1 godzina Antropometria: zostaną zarejestrowane dane, w tym wzrost (m), waga (kg), obwód talii (cm) i bioder (cm).

Historia medyczna: w tym aktualne leki i informacje o stylu życia (palenie/alkohol).

BOD POD: Uczestnicy zostaną poproszeni o zmierzenie ich masy tłuszczowej za pomocą BOD POD. Ta nieinwazyjna technika zapewnia dokładniejszy pomiar masy tłuszczowej w porównaniu z pomiarami bioimpedencji lub pomiarami wzrostu i masy ciała. Uczestnicy, którzy zrezygnują z tego testu, nie zostaną wykluczeni z badania.

Szczegółowe pomiary składu ciała zostaną uzyskane za pomocą systemu śledzenia składu ciała. W skrócie obejmuje to urządzenie BOD POD, wagi elektroniczne i komputer. Wykorzystuje zasady densytometrii ciała (pomiar masy i objętości) do obliczenia procentowej i bezwzględnej ilości tłuszczu i masy beztłuszczowej uczestnika. Uczestnicy zostaną poproszeni o założenie minimalnego ubioru (np. kostium kąpielowy) i dobrze dopasowany czepek do pływania. Stają na wadze elektrycznej, aby zarejestrować swoją wagę, która jest następnie kalibrowana za pomocą BOD POD. Uczestnicy proszeni są o siedzenie wewnątrz BOD POD przez maksymalnie 1 minutę na raz (maksymalnie 3 razy). Następnie komputer przeanalizuje i wygeneruje wyniki.

Próbki krwi:

Mała kaniula (cienka plastikowa rurka) zostanie wprowadzona do żyły zgodnie ze standardową praktyką kliniczną w celu zminimalizowania potencjalnego urazu spowodowanego powtórnym pobieraniem krwi.

Pobrane zostaną próbki na czczo do pomiarów wyjściowych (w tym rutynowych pomiarów glukozy i lipidów), DNA, osocza i surowicy do przechowywania i przyszłej analizy wsadowej, w tym pomiarów glukozy i insuliny oraz innych interesujących markerów.

Stymulowane próbki krwi zostaną pobrane od wszystkich uczestników. Wybór środka stymulującego będzie zależał od konkretnej badanej zmienności genetycznej. Pod koniec okresu testowego kaniula zostanie usunięta, a uczestnikowi zostanie zaoferowane śniadanie/przekąska.

Definicje interesujących genotypów i szczegóły wizyty (wizyt) podano w dodatkach do protokołu dotyczących poszczególnych kohort. Oprócz gromadzenia podstawowych danych, pomiarów i pobierania próbek na czczo, każda kohorta przeprowadzi do dwóch testów opisanych poniżej.

A: Wydzielanie insuliny indukowane argininą wzmocnione glukozą (GPAIS) - ok. 1½ godziny Uzasadnienie. Ten test jest przeznaczony przede wszystkim do sprawdzenia maksymalnej zdolności wydzielania insuliny przez komórki beta uczestnika. Zapewnia najlepszy dostępny surogat masy komórek beta, w przeciwieństwie do funkcji komórek beta (Kahn 2008), a zatem pomoże w lepszym zrozumieniu mechanizmów wpływu wybranych wariantów genetycznych na ryzyko cukrzycy. Niedawno wykazano, że dobrze koreluje z liczbą (autologicznych) wysepek przeszczepionych pacjentom z zapaleniem trzustki po pankreatektomii. U psów i naczelnych innych niż ludzie dobrze koreluje z % masy komórek beta (przegląd w Kahn 3). Test opiera się na dobrze opisanej (Kahn 2008; Larsson i Ahren 1998) zasadzie, że nieglukozowy środek zwiększający wydzielanie, taki jak aminokwas arginina, będzie wytwarzał większą odpowiedź na insulinę, gdy zostanie wzmocniony przez wysoki poziom glukozy, przy czym połączony bodziec wytwarza prawie maksymalną odpowiedź komórek beta.

Test GPAIS składa się z 5 etapów:

1. Organizować coś. Cewniki dożylne zostaną wprowadzone do żył przedłokciowych w obu ramionach. Jedno ramię będzie używane do wlewu glukozy/aminokwasu, a drugie ramię do okresowego pobierania próbek. Stężenie glukozy we krwi będzie monitorowane za pomocą regularnych pomiarów YSI przez cały czas trwania testu.
2. AIRarg (ostra odpowiedź insuliny na argininę). Próbki linii podstawowej zostaną pobrane w temperaturze -2 i -0 min. Maksymalnie stymulujący bolus chlorowodorku argininy (5 g) zostanie następnie wstrzyknięty dożylnie przez 45 sekund. Próbki będą pobierane w godzinach +2, +3, +4 i +5 min.
3. Ostra odpowiedź insulinowa na dożylną glukozę (niezweryfikowana miara ostrej odpowiedzi insulinowej na dożylną glukozę AIRglucose). Następnie zostanie rozpoczęty szybki (900 ml/godz.) wlew 20% glukozy trwający 10-25 minut (całkowita objętość wlewu do 410 ml). Próbki będą pobierane w czasie -5, -2 min (przed rozpoczęciem szybkiego wlewu), a następnie w odstępach 2-minutowych przez 10 minut po rozpoczęciu wlewu glukozy.
4. AIRMAXarg. Gdy poziom glukozy osiągnie 20 mmol/l (lub po maksymalnie 25 minutach), zostaną pobrane powtórne próbki linii bazowej, infuzja glukozy zostanie obniżona do 300 ml/godz. i zostanie wstrzyknięty drugi bolus chlorowodorku argininy (5 g), a Próbki 2, +3, +4 i +5 min.
5. Odzyskiwanie i monitorowanie poziomu glukozy i insuliny, gdy poziom glukozy u uczestnika powraca do wartości wyjściowych. Próbki glukozy i insuliny będą pobierane co 10 minut przez 50 minut po zakończeniu testu AIRMAXarg w celu monitorowania regeneracji uczestnika i pomiaru wrażliwości na insulinę. Poziom cukru we krwi będzie monitorowany za pomocą regularnych pomiarów YSI, dopóki poziom cukru we krwi uczestnika nie powróci do bezpiecznego poziomu. Na koniec tego okresu uczestnik otrzyma lekki lunch.

Próbki: we wszystkich punktach czasowych będzie mierzona insulina i glukoza. Zapasowe porcje zostaną zachowane i przechowywane w temperaturze -80oC do ewentualnych dodatkowych analiz, takich jak glukagon i peptyd C.

B: Dożylny test tolerancji glukozy (IGTT aka IVGTT) - ok. 30 minut Uzasadnienie. Ten test jest akceptowaną, standardową miarą pierwszej fazy wydzielania insuliny, która nie obejmuje efektów neurohormonalnych (inkretynowych) i absorpcyjnych doustnej prowokacji glukozą.

C: Doustny test tolerancji glukozy (OGTT) - ok. 2,5 godziny Uzasadnienie. Ten test jest akceptowaną, standardową miarą efektów wydzielania i wchłaniania insuliny podczas doustnej prowokacji glukozą.

D: Próbka kału do pomiaru elastazy w kale Uzasadnienie. Pozwoli to przetestować hipotezę, że polimorfizm genetyczny może wpływać na zewnątrzwydzielniczą funkcję trzustki oprócz funkcji endokrynnej trzustki.

Uczestnik otrzyma pojemnik na próbki, opłaconą z góry wyściełaną kopertę, pojemnik transportowy oraz instrukcję pobrania i wysłania próbki kału do analizy. Dostarczenie próbki kału będzie opcjonalne i nie będzie niezbędne do włączenia do badania.