Definire i meccanismi molecolari e fisiologici della disfunzione delle cellule delle isole pancreatiche che portano al diabete di tipo 2 (DIVA-Exeter)

Introduzione:

Lavorando con i collaboratori nell'ambito degli studi genetici in corso, i ricercatori hanno identificato diverse variazioni genetiche (cambiamenti del DNA) associate alla produzione e alla lavorazione dell'insulina e stanno cercando di capire come queste variazioni genetiche causino differenze nella capacità delle persone di produrre o elaborare l'insulina. Le loro scoperte porteranno a una migliore comprensione di come il pancreas produce ed elabora l'insulina dopo un pasto e contribuiranno a migliorare la comprensione del motivo per cui alcune persone sviluppano il diabete e altre no, nonostante livelli simili di obesità. Questa domanda è di grande importanza per la salute pubblica perché è improbabile che la prevalenza dell'obesità diminuisca drasticamente nel prossimo futuro.

I ricercatori vorrebbero verificare l'ipotesi che gli individui portatori di diverse variazioni genetiche abbiano capacità diverse di produrre o elaborare l'insulina. Testeranno le conseguenze di queste variazioni genetiche quando il pancreas deve produrre insulina in risposta a un pasto o componenti di un pasto, come zucchero o aminoacidi.

Disegno dello studio:

Questo è uno studio di coorte prospettico "recluta per genotipo" che testerà il ruolo di diverse varianti genetiche (o combinazioni di varianti) per un periodo di 4 anni (dalla fine del 2014 alla fine del 2018). Le varianti genetiche saranno scelte se vi è una forte evidenza che abbiano un ruolo nel pancreas e nella secrezione di insulina. Ogni variante genetica coinvolgerà un diverso insieme di volontari di ricerca e un insieme leggermente diverso di test. I partecipanti saranno accecati dal loro stato di variante genetica. Alcune varianti genetiche saranno identificate durante i prossimi 4 anni quindi non è possibile definire all'inizio una metodologia dettagliata per tutte le coorti da studiare. Questo protocollo è stato quindi scritto per descrivere un protocollo di base rilevante per l'intero studio, con appendici per descrivere coorti specifiche all'interno dello studio. Poiché la gestione generale e le questioni etiche sono generali, man mano che vengono identificate nuove varianti genetiche durante il periodo di studio di 4 anni, le appendici specifiche per coorte verranno aggiunte come modifiche principali, piuttosto che presentare ciascuna coorte come domanda etica separata. La procedura per il reclutamento e il test di ciascun gruppo di volontari di ricerca sarà la stessa ad eccezione di un componente che sarà delineato in appendici specifiche per coorte.

Partecipanti allo studio:

Tutti i partecipanti saranno identificati dalle coorti di ricerca esistenti gestite dal NIHR Exeter Research Facility (Exeter CRF) e/o dalla Oxford Biobank (OBB) e il reclutamento sarà facilitato all'interno dell'Exeter CRF e/o dell'Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Medicine ( OCDEM). Gli individui saranno identificati con la variante di interesse o come controlli abbinati a sesso, età e BMI. Tutti i potenziali partecipanti saranno "accecati" da un Data Manager in modo che il gruppo di studio non sappia quali partecipanti hanno la variante e quali sono i controlli. Saranno invitati a partecipare allo studio per lettera e riceveranno il foglio informativo dello studio e i recapiti del gruppo di studio. Un membro del team dello studio li contatterà entro 2-3 settimane per determinare se sono interessati a partecipare, per offrire loro maggiori spiegazioni su cosa comporta lo studio e per verificare la loro ammissibilità. Se accettano di partecipare, verrà richiesto il consenso verbale per una visita a digiuno e verrà fissato un appuntamento e confermato per iscritto/e-mail.

Identificare la variazione genetica:

Misurare i fattori genetici in questi individui è un processo in corso che coinvolge misurazioni di laboratorio di routine utilizzando il singolo campione di DNA esistente che i volontari hanno fornito durante la loro partecipazione all'Exeter 10000 Project/OBB. A giugno 2014, a Exeter sono state misurate 94 varianti genetiche (ovvero cambiamenti del DNA) in 5600 volontari EXTEND e 800.000 varianti genetiche in un sottogruppo di 1700 volontari EXTEND. Nel corso dei prossimi 4 anni, le misure genetiche saranno estese a tutti i partecipanti (fino a 10.000) ea tutte le varianti (800.000+). Questi dati verranno restituiti al database EXTEND/OBB come richiesto.

Gli individui identificati con una variazione genetica di interesse saranno invitati a partecipare (30-50, a seconda dei test specifici associati) insieme a un numero simile di individui di controllo corrispondenti per sesso, età e BMI senza la variazione di interesse. La definizione di abbinamento sarà lo stesso sesso, età +/- 1 anno e BMI entro 1 unità kgm2, ma questi intervalli possono essere ampliati se non sono disponibili abbastanza individui nella definizione più ristretta.

Procedura di visita:

A tutti i partecipanti verrà chiesto di digiunare durante la notte (dalle 22:00 della sera prima), evitare esercizi faticosi e fumare per 24 ore prima di partecipare a una visita mattutina presso l'Exeter CRF/OCDEM (circa 2-4 ore a seconda della scelta del test). Ai partecipanti verrà chiesto di firmare un modulo di consenso scritto prima di qualsiasi raccolta di dati o test. I pazienti privi di capacità di consenso non saranno reclutati. I partecipanti avranno l'opportunità di contattare un membro del gruppo di ricerca per discutere il progetto in modo più dettagliato, se lo desiderano. Tutti i partecipanti saranno informati della natura e dello scopo dello studio, dei suoi requisiti e dei possibili rischi e del loro diritto di ritirarsi in qualsiasi momento dallo studio senza pregiudizio e senza pericolo per qualsiasi futura assistenza clinica.

Tutti i partecipanti saranno sottoposti a raccolta di dati di base, misurazioni e forniranno campioni di sangue a digiuno e stimolati. A una coorte di partecipanti può essere chiesto di tornare per una seconda visita per sottoporsi a un ulteriore test per fornire misure di confronto. La scelta del test dipende dalla variazione genetica studiata, dettagliata nelle appendici specifiche per coorte.

Raccolta dati di base, misurazioni e campioni per tutti i partecipanti - ca. Antropometria di 1 ora: verranno registrati i dati, tra cui Altezza (m), Peso (Kg), Vita (cm) e Circonferenza fianchi (cm).

Anamnesi: compresi i farmaci attuali e le informazioni sullo stile di vita (fumo/alcol).

BOD POD: Ai partecipanti verrà chiesto di misurare la massa grassa tramite BOD POD. Questa tecnica non invasiva fornisce una misura più accurata della massa grassa rispetto alle misure di bioimpedenza, o misure di altezza e peso. I partecipanti che rinunciano a questo test non saranno esclusi dallo studio.

Le misure dettagliate della composizione corporea saranno ottenute utilizzando il sistema di monitoraggio della composizione corporea. Questo comprende brevemente una macchina BOD POD, bilance elettroniche e un computer. Utilizza i principi della densitometria corporea (misurazione della massa e del volume) per calcolare la percentuale del partecipante e la quantità assoluta di grasso e massa magra. Ai partecipanti verrà chiesto di indossare un abbigliamento minimo (ad es. costume da bagno) e una cuffia aderente. Stanno sulla bilancia elettrica per registrare il loro peso che viene poi calibrato con il BOD POD. Ai partecipanti viene chiesto di sedersi all'interno del BOD POD per un massimo di 1 minuto alla volta (massimo 3 volte). Il computer quindi analizzerà e genererà i risultati.

Campioni di sangue:

Una piccola cannula (sottile tubo di plastica) verrà inserita in una vena, seguendo la pratica clinica standard per ridurre al minimo qualsiasi potenziale trauma derivante dalla ripetizione del prelievo di sangue.

Verranno ottenuti campioni a digiuno per le misurazioni di base (inclusa la misurazione di routine del glucosio e dei lipidi), DNA, plasma e siero, per la conservazione e l'analisi futura in lotti, comprese le misurazioni di glucosio e insulina e altri marcatori di interesse.

I campioni di sangue stimolato saranno ottenuti da tutti i partecipanti. La scelta dell'agente di stimolazione dipenderà dalla specifica variazione genetica oggetto di studio. Al termine del periodo di prova, la cannula verrà rimossa e al partecipante verrà offerta la colazione/rinfreschi.

Le definizioni dei genotipi di interesse e i dettagli delle visite sono forniti nelle appendici specifiche della coorte del protocollo. Oltre alla raccolta dei dati di base, alle misurazioni e ai campioni a digiuno, ciascuna coorte eseguirà fino a due dei test descritti di seguito.

A: Secrezione di insulina indotta da arginina potenziata dal glucosio (GPAIS) - ca. 1 ora e mezza Razionale. Questo test è progettato principalmente per testare la massima capacità di secrezione di insulina delle cellule beta di un partecipante. Fornisce il miglior surrogato disponibile per la massa delle cellule beta, al contrario della funzione delle cellule beta (Kahn 2008) e contribuirà quindi a migliorare la comprensione dei meccanismi di come le varianti genetiche scelte influenzano il rischio di diabete. Recentemente è stato dimostrato che si correla bene con il numero di isole (autologhe) trapiantate in pazienti con pancreatite dopo pancreatectomia. Nei cani e nei primati non umani si correla bene con la % di massa cellulare beta (esaminata in Kahn 3). Il test si basa sul principio ben descritto (Kahn 2008; Larsson & Ahren 1998) secondo cui un secretagogo diverso dal glucosio, come l'amminoacido arginina, produrrà una maggiore risposta insulinica quando potenziato da alti livelli di glucosio, con lo stimolo combinato che produce una risposta quasi massima delle cellule beta.

Il test GPAIS prevede 5 fasi:

1. Impostare. I cateteri endovenosi verranno inseriti nelle vene antecubitali di entrambe le braccia. Un braccio verrà utilizzato per l'infusione di glucosio/aminoacidi e l'altro braccio per il campionamento intermittente. La concentrazione di glucosio nel sangue sarà monitorata con misurazioni YSI regolari durante il test.
2. AIRarg (risposta acuta dell'insulina all'arginina). I campioni basali saranno prelevati a -2 e -0 min. Una dose massima stimolante in bolo di cloridrato di arginina (5 g) verrà quindi iniettata per via endovenosa per 45 s. I campioni saranno raccolti a +2, +3, +4 e +5 min.
3. Risposta insulinica acuta al glucosio per via endovenosa (misura non convalidata della risposta insulinica acuta al glucosio per via endovenosa AIRglucose). Successivamente verrà avviata un'infusione di glucosio al 20% ad alta velocità (900 ml/ora) per 10-25 minuti (volume totale infuso fino a 410 ml). I campioni saranno raccolti a -5, -2 min (prima di iniziare l'infusione ad alta velocità) e poi a intervalli di 2 minuti per 10 minuti dopo l'inizio dell'infusione di glucosio.
4. AIRMAXarg. Quando i livelli di glucosio hanno raggiunto 20mmol/L (o dopo 25 minuti al massimo), verranno prelevati campioni ripetuti al basale, l'infusione di glucosio sarà ridotta a 300ml/ora e verrà iniettato un secondo bolo di arginina cloridrato (5 g), seguito da + finale Campioni da 2, +3, +4 e +5 min.
5. Recupero e monitoraggio del glucosio e dell'insulina quando i livelli di glucosio del partecipante tornano al basale. I campioni per il glucosio e l'insulina verranno raccolti ogni 10 minuti per 50 minuti dopo la fine del test AIRMAXarg per monitorare il recupero del partecipante e fornire una misura della sensibilità all'insulina. Lo zucchero nel sangue verrà monitorato con misure YSI regolari fino a quando lo zucchero nel sangue del partecipante non ritorna a un livello di sicurezza. Al termine di questo periodo, al partecipante verrà offerto un pranzo leggero.

Campioni: in ogni momento verranno misurati insulina e glucosio. Le aliquote di riserva verranno salvate e conservate a -80°C per potenziali analisi aggiuntive, come glucagone e C-peptide.

B: test di tolleranza al glucosio endovenoso (IGTT aka IVGTT) - ca. 30 minuti Motivazione. Questo test è una misura standard accettata della prima fase della secrezione di insulina che non coinvolge gli effetti neuroormonali (incretine) e di assorbimento di un test orale di glucosio.

C: Test orale di tolleranza al glucosio (OGTT) - ca. 2,5 ore Motivazione. Questo test è una misura standard accettata della secrezione di insulina e degli effetti di assorbimento di un test di glucosio orale.

D: Campione di feci per la misurazione dell'elastasi fecale Razionale. Questo metterà alla prova l'ipotesi che il polimorfismo genetico possa influenzare la funzione pancreatica esocrina oltre alla funzione endocrina pancreatica.

Al partecipante verrà fornito un contenitore per campioni, una busta imbottita prepagata, un contenitore per il trasporto e le istruzioni per raccogliere e inviare un campione fecale per l'analisi. La fornitura di un campione fecale sarà facoltativa e non sarà essenziale per l'inclusione nello studio.