Chrupavka vytvořená z autologních buněk pro opravu lézí kloubní chrupavky

Poraněná kloubní chrupavka má omezenou schopnost samoopravy. Bez včasné, včasné a účinné léčby se poškození kloubní chrupavky progresivně zhoršuje, což má za následek otoky kloubů, bolesti a dysfunkci. U pacienta se nakonec rozvine artróza a bude muset podstoupit umělou kloubní náhradu. Klinická terapie poškození chrupavky zahrnuje operaci mikrofraktur a autologní osteochondrální transplantaci. Technika mikrofraktur je však omezena na poškození malého rozsahu a autologní osteochondrální transplantaci brání omezená nabídka. S pokroky v materiálové vědě, buněčné biologii, biomechanice a technologii bioreaktorů nová generace biomimetických tkáňových osteochondrálních kompozitů vykazuje velký potenciál pro opravu poškození chrupavky.

V současnosti jsou v tkáňovém inženýrství chrupavky semenné buňky odvozeny z autologních nebo alogenních chondrocytů, mezenchymálních kmenových buněk, embryonálních kmenových buněk nebo pluripotentních kmenových buněk. Stále více důkazů ukazuje, že mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně mohou být indukovány k diferenciaci na chondrocyty a tyto buňky byly úspěšně použity při léčbě velkých kostních defektů, lézí chrupavky a poranění míchy. Kvalita a množství kostních mezenchymálních kmenových buněk se s věkem postupně snižuje, zejména u pacientů s degenerativními onemocněními. Tukové kmenové buňky a mezenchymální kmenové buňky z pupečníku jsou hojné a mají podobné vlastnosti jako kostní mezenchymální kmenové buňky a oba tyto typy buněk mohou být indukovány k diferenciaci na chondrocyty. Tukové kmenové buňky a mezenchymální kmenové buňky z pupečníku byly použity k opravě defektů chrupavky, ale nálezy jsou stále předběžné a tyto buňky nelze sklízet ani kultivovat ve velkém množství. Kromě toho je použití embryonálních kmenových buněk komplikováno etickými ohledy. V důsledku toho jsou autologní chondrocyty optimálními semennými buňkami pro tkáňové inženýrství chrupavky.

Transplantace autologních chondrocytů v kombinaci s tkáňovým inženýrstvím skeletu chrupavky k opravě poškození chrupavky vyžaduje, aby se výzkumníci zaměřili na dva hlavní problémy, a to (i) in vitro amplifikace chondrocytů a (ii) přípravu biokompatibilních chondrocytových skeletů. Příprava chondrocytových scaffoldů vyžaduje pokročilou techniku ​​a v současné době má kapacitu na výrobu acelulární chrupavky pouze Ústav ortopedie v čínské PLA General Hospital; v Číně neexistuje žádný jiný zdroj tkáňového inženýrství lešení chrupavky.

Vlastní alogenní acelulární lešení orientované na chrupavku bylo úspěšně vytvořeno výzkumnou skupinou Cartilage Tissue Engineering Research Group, Institute of Ortopedics, Chinese PLA General Hospital (s právy duševního vlastnictví). Inovativní lešení simuluje složení a prostorové strukturální charakteristiky normální chrupavky. Způsoby přípravy jsou následující: kloubní chrupavka se rozmělní na prášek, aby se získala přirozená chrupavková extracelulární matrix, která je biochemickým složením identická s extracelulární matrix přirozené kloubní chrupavky. Poté se připraví porézní houbovité lešení pomocí techniky lyofilizace. Experimenty in vitro a experimenty s opravou poranění kloubní chrupavky na velkých zvířatech přinesly dobré výsledky. S použitím tohoto materiálu naše výzkumná skupina připravila biomimetické tkáňové lešení chrupavky, které napodobuje strukturální charakteristiky přirozené extracelulární matrix kloubní chrupavky. Toto alogenní acelulární lešení chrupavky má následující vlastnosti: (1) je odvozeno z alogenní chrupavky a extracelulární matrice zůstává po aloštěpu nedotčená, což pomáhá udržovat četné složky normální chrupavky, zejména kolagen typu II a proteoglykany, což vede ke zvýšené opravě . Chrupavkové lešení používané mimo Čínu se skládá hlavně z kolagenu typu I a III nebo kyseliny hyaluronové a značně se liší od přirozených složek chrupavky. Původní struktura chrupavky se s těmito typy lešení obtížně reprodukuje a vazivová chrupavka může ovlivnit výsledek léčby. (2) Biomimetické lešení má podobnou trojrozměrnou strukturu jako normální kloubní chrupavka, což je orientovaná struktura lešení. Scaffold napodobuje orientaci normálních buněk chrupavky, které jsou uspořádány kolmo k povrchu, a poskytuje souřadnou sloupcovou strukturu, která přispívá ke sloupcovému uspořádání buněk. Tato struktura v kombinaci s kolagenem typu II a proteoglykany odvozenými z normální kloubní chrupavky má za následek strukturu lešení, která je extrémně blízká struktuře normální kloubní chrupavky. V důsledku toho bude mít opravená chrupavka normální strukturu a funkci. (3) Orientované lešení má dobré biomechanické vlastnosti. Jeho tlakové namáhání je lepší než u neorientovaného lešení za mokra i za sucha. (4) Orientované lešení má dobrou biokompatibilitu. Předběžné experimenty zkoumaly imunitní reakce orientovaného skeletu heterogenní (prasečí) a konspecifické (králičí) acelulární chrupavky. Po implantaci orientovaného skafoldu do králíka byly pozorovány jeho imunitní reakce z hlediska buněčné imunity a humorální imunity. Výsledky naznačují, že jeho imunogenicita byla nízká. Je tedy ověřeno, že orientované lešení acelulární chrupavky má dobrou biokompatibilitu.

Nežádoucí příhody

1. Bezpečnost Budou vypracovány standardní provozní postupy pro nežádoucí a závažné nežádoucí události, aby bylo zajištěno, že jakékoli nežádoucí reakce během experimentu budou rychle ošetřeny, aby byli účastníci chráněni.

2. Definice 2.1 Nežádoucí příhody Nežádoucí zdravotní příhody se mohou objevit po transplantaci chrupavky nebo po operaci mikrofraktur, ale nemusí mít nutně příčinnou souvislost s léčbou.

   Mezi časté nežádoucí reakce po transplantaci chrupavky patří horečka, bolesti kloubů, otoky a výpotek. Mezi běžné nežádoucí reakce po operaci mikrofraktur patří horečka, bolest kloubů, otoky kloubů a výpotek.

   2.2 Závažnost nežádoucích příhod Nežádoucí příhody budou klasifikovány do tří úrovní: obecné nežádoucí příhody, životně důležité nežádoucí příhody a závažné nežádoucí příhody.

   2.3 Vztah s chrupavkou tkáňového inženýrství Korelace mezi nežádoucími účinky a chrupavkou tkáňového inženýrství bude rozdělena do kategorií „určitě související“, „pravděpodobně související“, „možná nesouvisející“, „irelevantní“ nebo „neurčeno“.

   2.4 Závažné nežádoucí příhody Všechny příhody, které se vyskytnou během studie, vyžadující hospitalizaci nebo prodlouženou hospitalizaci, nebo mající za následek invaliditu nebo ovlivňující schopnost pracovat, nebo s rizikem smrti nebo život ohrožující příhody, budou zaznamenány.

3. Záznam nežádoucích příhod Všechny nežádoucí příhody během experimentu budou shromažďovány až do konce studie.

4. Zaznamenávání a hlášení Lékaři zaznamenají všechny nežádoucí příhody, včetně popisu nežádoucích příhod, doby výskytu, času ukončení, závažnosti, frekvence a záznamu o léčbě.

   Jakmile dojde k závažné nežádoucí příhodě, lékaři nejen poskytnou nezbytnou léčbu, ale také pravdivě oznámí místnímu úřadu pro kontrolu potravin a léčiv a Národnímu úřadu úřadu pro kontrolu potravin a léčiv do 24 hodin a také neprodleně podají zprávu etické komisi. Údaje, výsledky léčby a následné kontroly budou uvedeny ve zprávě.

5. Následné sledování nezávažných a závažných nežádoucích příhod Pokud pacient trpí nezávažnou nežádoucí příhodou, bude průběh a výsledek pečlivě sledován. Průběh závažných nežádoucích příhod bude zaznamenán v následných zprávách nebo souhrnných zprávách. Pacienti budou také sledováni a pozorování budou zaznamenávána po dobu 30 dnů po záchvatu.

Statistická analýza

1. Studijní hypotézy Všechny hypotézy budou vyhodnoceny pomocí dvoustranných testů. Hodnota P < 0,05 bude považována za statisticky významnou. Bude posouzena srovnatelnost výchozích dat. Dvoustranná statistická analýza bude provedena s α = 5 %.
2. Počet případů Do této studie bude zapojeno celkem 100 pacientů, kteří budou rozděleni do dvou skupin, po 50 případech v každé skupině.
3. Experimentální analýza Experimentální data budou analyzována pomocí statistického softwaru SPSS 22.0. Data měření budou vyjádřena jako průměr ± SD, medián, maximum, minimum a kvartily; údaje o počtu budou uvedeny v procentech (%). Údaje o počtu mezi skupinami budou porovnány pomocí chí-kvadrát testu nebo Fisherova exaktního testu. Data měření mezi skupinami budou porovnána pomocí t-testu. Neparametrické proměnné mezi skupinami budou porovnány pomocí rank sum testu.
4. Statistická analýza Statistická analýza bude provedena profesionálními statistiky, kteří se nebudou podílet na studii. Všechna data budou vložena a přezkoumána a bude připravena zpráva o statistické analýze.

Správa

1. Konzervace kloubní chrupavky Tkáň chrupavky bude konzervována a transportována v 50ml centrifugační zkumavce obsahující 8 ml roztoku pro uchování tkáně, umístěné na stojanu na zkumavky na ledovém obalu, při 4 °C za sterilních podmínek. Chrupavková tkáň bude do 12 hodin převezena do Ústavu ortopedie ve Všeobecné nemocnici Čínské lidové republiky.
2. Kultivace a konzervace chondrocytů Autologní chondrocyty budou kultivovány a amplifikovány v přísném souladu s normami a požadavky Národního institutu pro kontrolu potravin a léčiv. Všechny snímky a data budou zaznamenány. Buňky semen chrupavky budou zmrazeny v kapalném dusíku.
3. Zajištění kvality dat (1) Výzkumníci přesně vyplní formulář pro případovou zprávu (CRF). (2) Inspektoři budou pravidelně ověřovat správnost a úplnost všech zaznamenaných údajů a shodu s původními záznamy a budou rychle předány správci údajů. (3) Správce dat dále prozkoumá tabulky CRF a vrátí formulář výzkumníkům. (4) Dva datoví referenti vloží duplicitní data do počítačové databáze. (5) Dva samostatné soubory údajů budou porovnány pomocí počítačového softwaru a upraveny podle CRF. (6) Kontrola kvality: 5 % všech údajů o případu bude náhodně vybráno pro ruční kontrolu. Pokud je chyba dat větší než 0,15 %, všechna data v databázi budou ručně zkontrolována.