Cartilagine ingegnerizzata da tessuto derivato da cellule autologhe per la riparazione di lesioni della cartilagine articolare

La cartilagine articolare danneggiata ha una capacità limitata di autoriparazione. Senza un trattamento tempestivo, precoce ed efficace, il danno alla cartilagine articolare peggiora progressivamente, con conseguente gonfiore articolare, dolore e disfunzione. Il paziente alla fine sviluppa l'artrosi e sarà tenuto a sottoporsi a sostituzione artificiale dell'articolazione. La terapia clinica per il danno cartilagineo comprende la chirurgia delle microfratture e il trapianto osteocondrale autologo. Tuttavia, la tecnica della microfrattura è limitata a danni su piccola scala e il trapianto osteocondrale autologo è ostacolato dalla disponibilità limitata. Con i progressi nella scienza dei materiali, nella biologia cellulare, nella biomeccanica e nella tecnologia dei bioreattori, la nuova generazione di compositi osteocondrali di ingegneria tissutale biomimetica mostra un grande potenziale per la riparazione del danno cartilagineo.

Attualmente, nell'ingegneria del tessuto cartilagineo, le cellule seme sono derivate da condrociti autologhi o allogenici, cellule staminali mesenchimali, cellule staminali embrionali o cellule staminali pluripotenti. Prove crescenti indicano che le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo possono essere indotte a differenziarsi in condrociti e queste cellule sono state utilizzate con successo nel trattamento di difetti ossei di grandi dimensioni, lesioni della cartilagine e lesioni del midollo spinale. La qualità e la quantità delle cellule staminali mesenchimali ossee diminuiscono gradualmente con l'età, soprattutto nei pazienti con malattie degenerative. Le cellule staminali adipose e le cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale sono abbondanti e hanno caratteristiche simili alle cellule staminali mesenchimali ossee, ed entrambi questi tipi di cellule possono essere indotti a differenziarsi in condrociti. Le cellule staminali adipose e le cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale sono state utilizzate per riparare i difetti della cartilagine, ma i risultati sono ancora preliminari e queste cellule non possono essere raccolte o coltivate in grandi quantità. Inoltre, l'uso delle cellule staminali embrionali è complicato da considerazioni etiche. Di conseguenza, i condrociti autologhi sono cellule seme ottimali per l'ingegneria del tessuto cartilagineo.

Il trapianto di condrociti autologhi in combinazione con scaffold di cartilagine ingegnerizzati per riparare i danni alla cartilagine richiede ai ricercatori di concentrarsi su due questioni principali, vale a dire (i) l'amplificazione in vitro dei condrociti e (ii) la preparazione di scaffold di condrociti biocompatibili. La preparazione degli scaffold di condrociti richiede una tecnica avanzata e, attualmente, solo l'Istituto di ortopedia del Chinese PLA General Hospital ha la capacità di produrre cartilagine acellulare; non esiste altra fonte di impalcature di cartilagine di ingegneria tessutale in Cina.

Un'impalcatura proprietaria orientata alla cartilagine acellulare allogenica è stata creata con successo dal Cartilage Tissue Engineering Research Group, Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital (con diritti di proprietà intellettuale). L'innovativo scaffold simula la composizione e le caratteristiche strutturali spaziali della normale cartilagine. I metodi di preparazione sono i seguenti: la cartilagine articolare viene polverizzata per ottenere la matrice extracellulare della cartilagine naturale, che è identica nella composizione biochimica alla matrice extracellulare della cartilagine articolare naturale. Quindi, un'impalcatura porosa simile a una spugna viene preparata utilizzando la tecnica della liofilizzazione. Gli esperimenti in vitro e gli esperimenti di riparazione delle lesioni della cartilagine articolare di grandi animali hanno prodotto buoni risultati. Utilizzando questo materiale, il nostro gruppo di ricerca ha preparato impalcature biomimetiche di ingegneria tissutale della cartilagine, che imitano le caratteristiche strutturali della matrice extracellulare naturale della cartilagine articolare. Questa impalcatura cartilaginea acellulare allogenica ha le seguenti caratteristiche: (1) deriva dalla cartilagine allogenica e la matrice extracellulare rimane intatta dopo l'allotrapianto, contribuendo a mantenere i numerosi componenti della cartilagine normale, in particolare il collagene di tipo II e i proteoglicani, con conseguente miglioramento della riparazione . Le impalcature cartilaginee utilizzate al di fuori della Cina sono composte principalmente da collagene di tipo I e III o acido ialuronico e variano notevolmente dai componenti naturali della cartilagine. La struttura originale della cartilagine è difficile da riprodurre con questi tipi di scaffold e la cartilagine fibrosa può influenzare l'esito del trattamento. (2) L'impalcatura biomimetica ha una struttura tridimensionale simile a quella della normale cartilagine articolare, che è la struttura dell'impalcatura orientata. L'impalcatura imita l'orientamento delle normali cellule cartilaginee, che sono disposte perpendicolarmente alla superficie, e fornisce una struttura colonnare paratattica che contribuisce alla disposizione colonnare delle cellule. Questa struttura in combinazione con il collagene di tipo II e i proteoglicani derivati ​​dalla normale cartilagine articolare si traduce in una struttura dell'impalcatura che è estremamente vicina a quella della normale cartilagine articolare. Di conseguenza, la cartilagine riparata avrà struttura e funzione normali. (3) L'impalcatura orientata ha una buona proprietà biomeccanica. La sua sollecitazione di compressione è migliore dell'impalcatura non orientata in condizioni umide e asciutte. (4) L'impalcatura orientata ha una buona biocompatibilità. Esperimenti preliminari hanno studiato le risposte immunitarie dello scaffold orientato di cartilagine acellulare eterogenea (suina) e conspecifica (coniglio). Dopo che l'impalcatura orientata è stata impiantata nel coniglio, le sue risposte immunitarie sono state osservate dagli aspetti dell'immunità cellulare e dell'immunità umorale. I risultati hanno suggerito che la sua immunogenicità era bassa. Pertanto, si verifica che l'impalcatura orientata della cartilagine acellulare ha una buona biocompatibilità.

Eventi avversi

1. Sicurezza Saranno sviluppate procedure operative standard per eventi avversi e eventi avversi gravi per garantire che eventuali reazioni avverse durante l'esperimento vengano trattate rapidamente per proteggere i partecipanti.

2. Definizioni 2.1 Eventi avversi Gli eventi medici avversi possono verificarsi dopo il trapianto di cartilagine o l'intervento di microfrattura, ma non hanno necessariamente una relazione causale con il trattamento.

   Le reazioni avverse comuni dopo il trapianto di cartilagine includono febbre, dolori articolari, gonfiore e versamento. Le reazioni avverse comuni dopo l'intervento di microfrattura includono febbre, dolore articolare, gonfiore articolare e versamento.

   2.2 La gravità degli eventi avversi Gli eventi avversi saranno classificati in tre livelli: eventi avversi generali, eventi avversi vitali ed eventi avversi gravi.

   2.3 Relazione con cartilagine di ingegneria tissutale La correlazione tra eventi avversi e cartilagine di ingegneria tissutale sarà classificata in "sicuramente correlata", "probabilmente correlata", "possibilmente non correlata", "irrilevante" o "indeterminata".

   2.4 Eventi avversi gravi Verranno registrati tutti gli eventi verificatisi durante lo studio che richiedono il ricovero ospedaliero o il ricovero prolungato, o che comportano disabilità, o compromettono la capacità lavorativa, o che comportano un rischio di morte o eventi che mettono in pericolo la vita.

3. Registrazione degli eventi avversi Tutti gli eventi avversi durante l'esperimento saranno raccolti fino alla fine dello studio.

4. Registrazione e segnalazione Tutti gli eventi avversi saranno registrati dai medici, compresa la descrizione degli eventi avversi, l'ora in cui si sono verificati, l'ora di fine, la gravità, la frequenza e la registrazione del trattamento.

   Una volta che si verifica un evento avverso grave, i medici non solo forniranno le cure necessarie, ma riferiranno anche in modo veritiero al locale Food and Drug Administration Bureau e al National Food and Drug Administration Bureau entro 24 ore, nonché riferiranno prontamente al Comitato etico. I dati, il trattamento ei risultati del follow-up saranno annotati nel referto.

5. Osservazione di follow-up di eventi avversi non gravi e gravi Se un paziente soffre di un evento avverso non grave, il decorso e l'esito saranno attentamente monitorati. Il decorso degli eventi avversi gravi verrà registrato nei rapporti di follow-up o nei rapporti di sintesi. I pazienti saranno anche monitorati e le osservazioni saranno registrate per un periodo di 30 giorni dopo un attacco.

Analisi statistica

1. Ipotesi di studio Tutte le ipotesi saranno valutate con test a due code. Un valore di P < 0,05 sarà considerato statisticamente significativo. Sarà valutata la comparabilità dei dati di base. L'analisi statistica a due code sarà eseguita con α = 5%.
2. Numero di casi Un totale di 100 pazienti saranno coinvolti in questo studio e divisi in due gruppi, con 50 casi in ciascun gruppo.
3. Analisi sperimentale I dati sperimentali saranno analizzati utilizzando il software statistico, SPSS 22.0. I dati di misurazione saranno espressi come media ± SD, mediana, massimo, minimo e quartili; i dati di conteggio saranno presentati come percentuale (%). I dati di conteggio tra i gruppi saranno confrontati utilizzando il test chi-quadrato o il test esatto di Fisher. I dati di misurazione tra i gruppi saranno confrontati utilizzando il t-test. Le variabili non parametriche tra i gruppi saranno confrontate utilizzando il test della somma dei ranghi.
4. Analisi statistica L'analisi statistica sarà eseguita da statistici professionisti che non saranno coinvolti nello studio. Tutti i dati verranno inseriti e rivisti e verrà preparato un rapporto di analisi statistica.

Amministrazione

1. Conservazione della cartilagine articolare Il tessuto cartilagineo sarà conservato e trasportato in una provetta da centrifuga da 50 mL contenente 8 mL di soluzione per la conservazione dei tessuti, posta su un portaprovette sopra un impacco di ghiaccio, a 4 °C in condizioni sterili. Il tessuto cartilagineo sarà trasferito all'Istituto di Ortopedia del Chinese PLA General Hospital entro 12 ore.
2. Coltivazione e conservazione dei condrociti I condrociti autologhi saranno coltivati ​​e amplificati in stretta conformità con gli standard ei requisiti del National Institutes for Food and Drug Control. Tutte le immagini ei dati verranno registrati. Le cellule seme della cartilagine saranno congelate in azoto liquido.
3. Assicurazione della qualità dei dati (1) I ricercatori compileranno accuratamente un case report form (CRF). (2) Gli ispettori verificheranno regolarmente che tutti i dati registrati siano corretti e completi e che siano coerenti con le registrazioni originali e saranno rapidamente trasferiti all'amministratore dei dati. (3) L'amministratore dei dati esaminerà ulteriormente le tabelle CRF e restituirà il modulo ai ricercatori. (4) Due addetti ai dati inseriranno dati duplicati in un database informatico. (5) I due insiemi separati di dati saranno confrontati da un software informatico e modificati secondo il CRF. (6) Controllo di qualità: il 5% di tutti i dati del caso sarà selezionato casualmente per il controllo manuale. Se l'errore dei dati è maggiore dello 0,15%, tutti i dati nel database verranno controllati manualmente.