Autologiczna chrząstka tkankowa pochodząca z komórek do naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej

Uszkodzona chrząstka stawowa ma ograniczoną zdolność do samonaprawy. Bez szybkiego, wczesnego i skutecznego leczenia uszkodzenie chrząstki stawowej stopniowo się pogarsza, powodując obrzęk stawów, ból i dysfunkcję. U pacjenta ostatecznie rozwija się choroba zwyrodnieniowa stawów i konieczne będzie poddanie się sztucznej wymianie stawu. Terapia kliniczna uszkodzenia chrząstki obejmuje chirurgię mikrozłamań i autologiczny przeszczep chrzęstno-kostny. Jednak technika mikrozłamań jest ograniczona do uszkodzeń na małą skalę, a autologiczne przeszczepy kostno-chrzęstne są utrudnione z powodu ograniczonej podaży. Dzięki postępom w materiałoznawstwie, biologii komórki, biomechanice i technologii bioreaktorów, nowa generacja biomimetycznych kompozytów tkankowo-kostno-chrzęstnych wykazuje ogromny potencjał w naprawie uszkodzeń chrząstki.

Obecnie w inżynierii tkanki chrzęstnej komórki nasienne uzyskuje się z autologicznych lub allogenicznych chondrocytów, mezenchymalnych komórek macierzystych, embrionalnych komórek macierzystych lub pluripotencjalnych komórek macierzystych. Coraz więcej dowodów wskazuje, że mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego mogą być indukowane do różnicowania się w chondrocyty, a komórki te są z powodzeniem stosowane w leczeniu dużych ubytków kostnych, uszkodzeń chrząstki i urazów rdzenia kręgowego. Jakość i ilość mezenchymalnych komórek macierzystych kości stopniowo zmniejsza się wraz z wiekiem, zwłaszcza u pacjentów z chorobami zwyrodnieniowymi. Tłuszczowe komórki macierzyste i mezenchymalne komórki macierzyste pępowiny są liczne i mają podobne właściwości do mezenchymalnych komórek macierzystych kości, a oba te typy komórek można indukować do różnicowania się w chondrocyty. Tłuszczowe komórki macierzyste i mezenchymalne komórki macierzyste pępowiny zostały wykorzystane do naprawy defektów chrząstki, ale odkrycia są nadal wstępne, a komórek tych nie można zbierać ani hodować w dużych ilościach. Ponadto stosowanie embrionalnych komórek macierzystych jest skomplikowane ze względów etycznych. W konsekwencji autologiczne chondrocyty są optymalnymi komórkami nasiennymi do inżynierii tkanki chrzęstnej.

Przeszczepianie autologicznych chondrocytów w połączeniu z rusztowaniami chrząstki uzyskanymi metodą inżynierii tkankowej w celu naprawy uszkodzeń chrząstki wymaga od badaczy skupienia się na dwóch głównych zagadnieniach, a mianowicie (i) amplifikacji chondrocytów in vitro oraz (ii) przygotowaniu biokompatybilnych rusztowań chondrocytów. Przygotowanie rusztowań chondrocytów wymaga zaawansowanej techniki, a obecnie tylko Instytut Ortopedii w Chińskim Szpitalu Ogólnym PLA ma zdolność wytwarzania chrząstki bezkomórkowej; w Chinach nie ma innego źródła rusztowań chrzęstnych wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej.

Zastrzeżone allogeniczne bezkomórkowe rusztowanie zorientowane na chrząstkę zostało pomyślnie stworzone przez Grupę Badawczą Inżynierii Tkanki Chrząstki, Instytut Ortopedii, Chiński Szpital Ogólny PLA (z prawami własności intelektualnej). Innowacyjne rusztowanie symuluje skład i przestrzenne cechy strukturalne normalnej chrząstki. Metody przygotowania są następujące: chrząstka stawowa jest proszkowana w celu uzyskania naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki, która pod względem składu biochemicznego jest identyczna z macierzą zewnątrzkomórkową naturalnej chrząstki stawowej. Następnie techniką liofilizacji przygotowuje się porowate rusztowanie przypominające gąbkę. Eksperymenty in vitro i eksperymenty naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej na dużych zwierzętach przyniosły dobre wyniki. Korzystając z tego materiału, nasza grupa badawcza przygotowała biomimetyczne rusztowania z tkanki chrzęstnej, które naśladują cechy strukturalne naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki stawowej. To rusztowanie z allogenicznej chrząstki bezkomórkowej ma następujące cechy: (1) pochodzi z chrząstki allogenicznej, a macierz zewnątrzkomórkowa pozostaje nienaruszona po przeszczepie allogenicznym, pomagając w utrzymaniu licznych składników normalnej chrząstki, w szczególności kolagenu typu II i proteoglikanów, co skutkuje zwiększoną naprawą . Rusztowania chrząstki stosowane poza Chinami składają się głównie z kolagenu typu I i III lub kwasu hialuronowego i znacznie różnią się od naturalnych składników chrząstki. Oryginalna struktura chrząstki jest trudna do odtworzenia przy użyciu tego typu rusztowań, a chrząstka włóknista może wpływać na wynik leczenia. (2) Rusztowanie biomimetyczne ma podobną trójwymiarową strukturę jak normalna chrząstka stawowa, która jest zorientowaną strukturą rusztowania. Rusztowanie imituje orientację normalnych komórek chrząstki, które są ułożone prostopadle do powierzchni i zapewnia parataktyczną strukturę kolumnową, która przyczynia się do kolumnowego ułożenia komórek. Ta struktura w połączeniu z kolagenem typu II i proteoglikanami pochodzącymi z normalnej chrząstki stawowej daje strukturę rusztowania, która jest bardzo zbliżona do struktury normalnej chrząstki stawowej. W rezultacie naprawiona chrząstka będzie miała normalną strukturę i funkcję. (3) Zorientowane rusztowanie ma dobre właściwości biomechaniczne. Jego naprężenie ściskające jest lepsze niż rusztowanie niezorientowane w mokrych i suchych warunkach. (4) Zorientowane rusztowanie ma dobrą biokompatybilność. We wstępnych eksperymentach zbadano odpowiedzi immunologiczne zorientowanego rusztowania heterogennej (świńskiej) i tego samego gatunku (króliczej) bezkomórkowej chrząstki. Po wszczepieniu zorientowanego rusztowania królikowi obserwowano jego odpowiedzi immunologiczne pod kątem odporności komórkowej i odporności humoralnej. Wyniki sugerowały, że jego immunogenność była niska. W ten sposób zweryfikowano, że zorientowane rusztowanie chrząstki bezkomórkowej ma dobrą biokompatybilność.

Zdarzenia niepożądane

1. Bezpieczeństwo Zostaną opracowane standardowe procedury operacyjne dotyczące zdarzeń niepożądanych i poważnych zdarzeń niepożądanych, aby zapewnić szybką reakcję na wszelkie niepożądane reakcje podczas eksperymentu w celu ochrony uczestników.

2. Definicje 2.1 Zdarzenia niepożądane Niepożądane zdarzenia medyczne mogą wystąpić po przeszczepie chrząstki lub operacji mikrozłamań, ale niekoniecznie mają związek przyczynowy z leczeniem.

   Częste działania niepożądane po przeszczepie chrząstki obejmują gorączkę, ból stawów, obrzęk i wysięk. Częste działania niepożądane po operacji mikrozłamań obejmują gorączkę, ból stawów, obrzęk stawów i wysięk.

   2.2 Nasilenie zdarzeń niepożądanych Zdarzenia niepożądane zostaną podzielone na trzy poziomy: ogólne zdarzenia niepożądane, istotne zdarzenia niepożądane i ciężkie zdarzenia niepożądane.

   2.3 Związek z chrząstką uzyskaną metodą inżynierii tkankowej Korelacja między zdarzeniami niepożądanymi a chrząstką uzyskaną dzięki inżynierii tkankowej zostanie sklasyfikowana jako „zdecydowanie powiązana”, „prawdopodobnie powiązana”, „prawdopodobnie niepowiązana”, „nieistotna” lub „nieokreślona”.

   2.4 Poważne zdarzenia niepożądane Wszystkie zdarzenia, które wystąpiły w trakcie badania i wymagały hospitalizacji lub przedłużonej hospitalizacji, skutkujące niepełnosprawnością lub wpływające na zdolność do pracy, lub z ryzykiem zgonu lub zdarzeń zagrażających życiu, zostaną zarejestrowane.

3. Rejestrowanie zdarzeń niepożądanych Wszystkie zdarzenia niepożądane podczas eksperymentu będą gromadzone do końca badania.

4. Rejestrowanie i zgłaszanie Wszystkie zdarzenia niepożądane będą rejestrowane przez lekarzy, w tym opis zdarzeń niepożądanych, czas wystąpienia, czas zakończenia, nasilenie, częstotliwość i zapis leczenia.

   W przypadku wystąpienia poważnego zdarzenia niepożądanego lekarze nie tylko udzielą niezbędnego leczenia, ale również zgłoszą się zgodnie z prawdą do lokalnego Biura ds. Żywności i Leków oraz do Krajowego Biura ds. Dane, leczenie i wyniki obserwacji zostaną odnotowane w raporcie.

5. Kontrolna obserwacja mniej poważnych i ciężkich zdarzeń niepożądanych Jeśli u pacjenta wystąpi mniej poważne zdarzenie niepożądane, przebieg i wyniki będą ściśle monitorowane. Przebieg ciężkich działań niepożądanych zostanie odnotowany w raportach kontrolnych lub raportach podsumowujących. Pacjenci będą również monitorowani, a obserwacje będą rejestrowane przez okres 30 dni po napadzie.

Analiza statystyczna

1. Hipotezy badawcze Wszystkie hipotezy zostaną ocenione za pomocą testów dwustronnych. Wartość P < 0,05 będzie uważana za istotną statystycznie. Oceniona zostanie porównywalność danych wyjściowych. Dwustronna analiza statystyczna zostanie przeprowadzona z α = 5%.
2. Liczba przypadków W tym badaniu weźmie udział łącznie 100 pacjentów, którzy zostaną podzieleni na dwie grupy, po 50 przypadków w każdej grupie.
3. Analiza eksperymentalna Dane eksperymentalne zostaną przeanalizowane przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS 22.0. Dane pomiarowe zostaną wyrażone jako średnia ± SD, mediana, maksimum, minimum i kwartyle; dane liczbowe zostaną przedstawione w procentach (%). Dane liczbowe między grupami zostaną porównane przy użyciu testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera. Dane pomiarowe pomiędzy grupami zostaną porównane za pomocą testu t. Zmienne nieparametryczne między grupami zostaną porównane za pomocą testu sumy rang.
4. Analiza statystyczna Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przez profesjonalnych statystyków, którzy nie będą zaangażowani w badanie. Wszystkie dane zostaną wprowadzone i zweryfikowane, a także przygotowany zostanie raport z analizy statystycznej.

Administracja

1. Konserwacja chrząstki stawowej Tkanka chrzęstna zostanie zakonserwowana i przetransportowana w probówce do wirowania o pojemności 50 ml zawierającej 8 ml roztworu do konserwacji tkanek, umieszczonej na statywie do probówek na wierzchu opakowania z lodem, w temperaturze 4 °C w sterylnych warunkach. Tkanka chrzęstna zostanie przekazana do Instytutu Ortopedii Chińskiego Szpitala Ogólnego PLA w ciągu 12 godzin.
2. Hodowla i konserwacja chondrocytów Autologiczne chondrocyty będą hodowane i amplifikowane w ścisłej zgodności ze standardami i wymaganiami National Institutes for Food and Drug Control. Wszystkie obrazy i dane zostaną zapisane. Komórki nasienne chrząstki zostaną zamrożone w ciekłym azocie.
3. Zapewnienie jakości danych (1) Badacze dokładnie wypełnią formularz opisu przypadku (CRF). (2) Inspektorzy będą regularnie weryfikować, czy wszystkie zarejestrowane dane są prawidłowe, kompletne i zgodne z oryginalnymi zapisami oraz zostaną szybko przekazane administratorowi danych. (3) Administrator danych dalej zbada tabele CRF i zwróci formularz badaczom. (4) Dwóch urzędników danych wprowadzi zduplikowane dane do komputerowej bazy danych. (5) Dwa oddzielne zestawy danych zostaną porównane przez oprogramowanie komputerowe i zmodyfikowane zgodnie z CRF. (6) Kontrola jakości: 5% wszystkich danych przypadku zostanie losowo wybranych do ręcznego sprawdzenia. Jeśli błąd danych jest większy niż 0,15%, wszystkie dane w bazie zostaną sprawdzone ręcznie.