Vliv znečištění ovzduší na spotřebu antimikrobiálních látek v obecné populaci (ONAIR)

Projekt ONAIR se bude skládat ze dvou dílčích studií popsaných níže:

STUDIE 1

1.1 Návrh: Dvoudílná analýza časové řady souvislostí mezi koncentrací hlavních znečišťujících látek v ovzduší (PM2,5, PM10, NO2, O3) v letech 2006 až 2022 a denní spotřebou antimikrobiálních látek běžnou populací.

1.2 Rozsah studie a autorizované zdroje informací: Studie bude provedena v 11 městech Katalánska s více než 100 000 obyvateli, rozmístěných ve čtyřech provinciích regionu. Tato města jsou domovem 3 283 501 lidí. Denní údaje o znečištění ovzduší budou získávány ze sítě pro monitorování a předpovědi znečištění atmosféry (XVPCA). Denní spotřeba antimikrobiálních látek bude odhadnuta z oficiálních údajů o předpisech zaznamenaných Radou College of Pharmacists of Catalonia (CCFC) autorizovanou ministerstvem zdravotnictví v Katalánsku. Sekundární klinické proměnné, které jsou předmětem studie, budou získány prostřednictvím Agentury pro hodnocení kvality a zdraví Katalánska.

1.3 Studijní předměty: Dospělí a děti žijící v 11 zkoumaných městech.

1.4 Definice: Znečištění ovzduší. To je definováno jako detekce jakékoli látky ve vzduchu, která může poškodit zdraví lidí, zvířat nebo rostlin nebo způsobit materiální škody. Znečištění ovzduší pochází z různých zdrojů; liší se podle svého složení, které se zase mění podle teploty a vlhkosti prostředí. Pro účely této studie, protože ne všechny monitorovací stanice kvality ovzduší zaznamenávají údaje o všech sloučeninách, budou analyzovány PM10, PM2,5, NO2 a 03. DDD (definovaná denní dávka). Jedná se o technickou jednotku měření a srovnání ekvivalentní průměrné denní udržovací dávce léku při použití v jeho hlavní indikaci specifikovanou cestou podání u dospělých, vyjádřenou jako množství účinné látky. Je definován a aktualizován Světovou zdravotnickou organizací (WHO) (https://www.whocc.no/ddd/definition_and_general_considera/#General). DDD/TID (definovaná denní dávka na tisíc obyvatel za den). Tento parametr je určen k porovnání spotřeby drog vyjádřené v počtu DDD pro různé geografické oblasti a/nebo časová období. Vypočítá se vynásobením počtu spotřebovaných DDD na tisíc obyvatel a vydělením počtem dnů v uvažovaném období a počtem obyvatel. Vzorec DDD/TID = (nºP x NºF x AF x 1000) / (DDD x nº obyvatel x nº dnů) (nºP = počet balíků vydaných denně. NºF = počet lékových forem (tj. pilulek, kapslí atd.) na balení. AP = množství účinné látky na lékovou formu). Jmenovatel populace: pro výpočet počtu obyvatel bude použit počet obyvatel (uživatelé s individuálními zdravotními průkazy a zařazení do pečovatelského centra) v péči každého praktického lékaře, vypočtený z dat informačního systému primární péče, včetně ošetřovatelství domácí obyvatelstvo.

1.5 Popis proměnných: Hlavní výsledná proměnná: definovaná denní dávka antimikrobiálních látek na 1000 obyvatel/den. Hlavní nezávislé proměnné: koncentrace PM10, PM2,5, NO2 a 03.

Matoucí proměnné: rok, den v týdnu, teplota a relativní vlhkost.

Sekundární výstupní proměnné: Definované denní náklady na antimikrobiální látky na 1000 obyvatel/den, úmrtnost z přirozených příčin, úmrtnost z respiračních příčin, hospitalizace z důvodu respiračních příčin a konzultace primární péče kvůli respiračním symptomům.

1.6 Sběr dat: Údaje o znečištění: Údaje o znečištění v 11 zkoumaných městech v letech 2006 až 2020 budou získány z XVPCA pro analýzu časových řad. V každé zóně kvality ovzduší lze identifikovat odlišné oblasti podle využití půdy (úroveň 1: městské, příměstské nebo venkovské oblasti) a typu zdrojů emisí (úroveň 2: doprava, průmysl nebo pozadí).

Budou zaznamenávány časové řady průměrné denní teploty a relativní vlhkosti od roku 2006 do roku 2020, měřené Katalánskou meteorologickou službou. Denní údaje o znečištění, teplotě a vlhkosti v těchto oblastech v letech 2021 a 2022 budou shromažďovány prospektivně. Den v týdnu a časová řada denních případů chřipky budou rovněž považovány za matoucí proměnné. Asociace koncentrací hlavních znečišťujících látek, denní spotřeba antimikrobiálních látek (DDD/TID) a popsané sekundární proměnné budou vyhodnoceny v samostatných analýzách za použití standardního přístupu časových řad, dvoufázového analytického protokolu, který byl široce používán v předchozích studie časových řad v mnoha různých městech. Údaje o populaci a spotřebě antimikrobiálních látek. Údaje budou shromažďovány podle věku (> 65 let), pohlaví a regionu.

Pro výpočet DDD/TID a vydaných nákladů/TID budou shromažďovány následující denní údaje podle PSČ: lék (kombinace účinné látky + léková forma + dávka + počet lékových forem v balení), ATC kód, počet vydaných balení, datum vydání a oficiální cena každého balení. Evidován bude také počet uživatelů s individuální zdravotní kartou a přiděleným pečovatelským centrem.

1.7 Statistická analýza: V první fázi budou v každém městě odhadnuty souvislosti mezi denní dávkou antibiotické terapie a hodnocenými látkami znečišťujícími ovzduší pomocí kvazi-Poissonových zobecněných lineárních modelů. Stejně jako v předchozích studiích budou do hlavního modelu zahrnuty následující kovariáty: rok (vyhlazený kubickými splajny) pro řízení trendu a časové sezónnosti indikátorů; proměnná udávající den v týdnu pro zohlednění týdenních krátkodobých změn; a teplota (vyhlazená křivkami) a relativní vlhkost (vyhlazená křivkami) pro řízení potenciálních nelineárních rušivých vlivů počasí v oblastech, ve kterých jsou tyto informace dostupné. Vzhledem k tomu, že možný účinek znečišťující látky na denní dávku antibiotika lze promítnout do následujících dnů, bude v odhadovaných modelech prozkoumána řada časových zpoždění. Stejný postup bude aplikován na teplotu. Ve druhé fázi bude model náhodných efektů použit k metaanalýze odhadů vztahu mezi znečišťující látkou a denní spotřebou antimikrobiálních látek v každém městě. Budou tak získány agregované odhady a jejich 95% intervaly spolehlivosti procentuální změny denní spotřeby antimikrobiálních látek pro každé zvýšení o 10 μg/m3. K hodnocení heterogenity mezi městy bude použit test I². Podobně budou odhadnuty modely pro posouzení souvislostí mezi sekundárními výstupními proměnnými a látkami znečišťujícími ovzduší. Statistická analýza bude provedena pomocí statistického balíčku R (verze 3.6.1 nebo vyšší (R Foundation for Statistical Computing) s použitím mgcv pro hlavní modely a rmeta pro model náhodných efektů. Statistická významnost bude uvažována pro p <0,05.

1.8 Omezení: Možným omezením může být obtížnost rozlišování mezi dopadem znečištění na spotřebu antibiotik jako přímým vztahem příčina-účinek nebo jako matoucím faktorem ve vztahu příčina-účinek mezi znečištěním ovzduší a respiračními exacerbacemi předchozí patologie.

STUDIE 2

2.1 Design: Popisná observační studie koncentrace genů antibiotické rezistence (ARG) v oblasti Barcelony v období 2021-2023. Budou vyhodnoceny rozdíly mezi koncentrací těchto genů na monitorovací stanici kvality ovzduší v blízkosti nemocnice a na jiné stanici jinde ve městě, stejně jako mezisezónní a meziměsíční rozdíly. Přítomnost určitých genů rezistence bude hodnocena ve vztahu ke spotřebě určitých skupin antimikrobiálních látek ve studované populaci.

2.2 Rozsah studie a zdroje informací: Studie bude provedena ve městě Barcelona. Vzorky znečištění ovzduší budou odebrány pro analýzu ze tří stanic monitorování kvality ovzduší XVPCA: jedna z nich v centru města, kde je značný objem dopravy, a druhá umístěná v blízkosti nemocnice třetího stupně.

2.3 Studijní předměty: Dospělí a děti žijící ve městě Barcelona.

2.4 Definice: ARG (gen antibiotické rezistence): fragment genomu mikroorganismu, který kóduje mechanismy antimikrobiální rezistence. Mikroorganismy mohou získat ARG buď dědičností nebo horizontálním přenosem genů z jiných mikroorganismů. Znečištění ovzduší: viz definice v podprojektu 1, oddíl 1.4.

2.5 Proměnné studie: Hlavní výsledná proměnná: Koncentrace genů rezistence na antibiotika/měsíc. Hlavní nezávislá proměnná: definovaná denní dávka antimikrobiálních látek na 1000 obyvatel/den.

2.6 Odběr: Odběr vzorků: Vzorky z filtrů používaných k měření koncentrací PM budou odebírány na třech stanicích v XVPCA zóně 1, odpovídající městu Barcelona. Vzorky budou odebírány na dvou stanicích reprezentujících znečištění související s městskou dopravou (Plaça Universitat a Poble Nou) a na další stanici reprezentující nemocniční oblast (Parc de Vall D'Hebron). Odběr vzorků bude probíhat každé první úterý v měsíci. Tímto způsobem budou provedena tři měsíční měření po dobu celkem 30 měsíců, celkem tedy bude odebráno 90 vzorků. Pokud během studie dojde k epizodě vysoké kontaminace, bude vyhodnocen extra odběr vzorků. Zaznamenány budou také meteorologické údaje odpovídající každému dni měření.

Zpracování vzorků: Vzorky budou odebírány pomocí velkoobjemových (30 m3) křemenných vláknitých filtrů (průměr 15 cm) Pallflex. Před použitím budou filtry sterilizovány při 205°C po dobu 5 hodin a kondicionovány po dobu 48 hodin při 20°C a 50% relativní vlhkosti. Každý filtr bude zvážen třikrát každých 24 hodin na mikrováhách s citlivostí 1 g. Po odběru budou filtry odvezeny do mikrobiologické laboratoře, kde budou odebrány vzorky PM2,5 následovně. Nejprve se filtr nařízne sterilizovanou řezačkou. Poté bude každý fragment filtru přidán do 2 ml sterilní čištěné vody s 0,05% roztokem Tween 20 ve sterilní centrifugační vaně; poté se provede 20minutová sonikace následovaná 40minutovým třepáním na vortexu při 2800 ot./min. Vzorky PM2,5 budou skladovány při -20ºC, dokud nebudou definitivně zpracovány. Extrakce DNA a sekvenování mikrobiální DNA pomocí brokovnice: Ze získaného ředění bude extrahováno 1 mg/ml. Extrakce DNA bude provedena automaticky pomocí zařízení KingFisher (ThermoFisher) se sadou MagMaxTM Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation (ThermoFisher). Knihovny budou vytvořeny pomocí sady Illumina Nextera-XT®.

Sekvenování bude provedeno 2x150bp na NextSeq550® od Illumina. Kvalita sekvencí bude analyzována pomocí programu FastQC1 a odpovídající filtrování bude provedeno pomocí programu Trimmomatic2. Lidská kontaminace bude eliminována mapováním sekvencí filtrovaných proti lidskému genomu pomocí programu Bowtie 23. K odvození mikrobiálního složení bude použit software Metaphlan v24. Pro studium rezistomu budou pomocí ResFinder 3.05 identifikovány získané geny antibiotické rezistence a chromozomální bodové mutace. Údaje o populaci a údaje o spotřebě antimikrobiálních látek: Tyto údaje budou shromažďovány stejným způsobem, jaký je popsán pro dílčí projekt 1 (viz část), ale v oblasti Barcelony a konkrétně v poštovních směrovacích číslech odpovídajících oblastem, kde se shromažďují metagenomická data.

2.7 Statistická analýza: Teplotní mapy budou vytvořeny pro relativní množství ARG na základě rozdílů 2-ΔCT. Síťová analýza bude provedena na základě Spearmanových rank korelací pro vizualizaci koincidence podtypů ARG ve vzduchu a v komunitách bakterií. Koncentrace ARG v různých měsících a ročních obdobích budou porovnány pomocí boxplotů. Kromě toho bude provedena Pearsonova korelace, která spojí koncentraci ARG se spotřebou antimikrobiálních látek ve zkoumaných oblastech. Pro posouzení bohatosti a diverzity bakteriální komunity bude Alfa diverzita vypočtena pomocí Mothur 1.30.1 v souladu s literaturou (Schloss et al, 2009) na úrovni spolehlivosti 95 %. Statistická analýza bude provedena pomocí statistického balíčku R verze 3.6.1 nebo vyšší (R Foundation for Statistical Computing).

2.8 Omezení: Hlavním omezením této dílčí studie je její popisná povaha. Zkoumané časové období neumožňuje stanovit přímé časové souvislosti mezi mírou znečištění ovzduší a koncentrací ARG v konkrétní den. Navíc vzhledem ke složitosti techniky lze provést pouze omezený počet stanovení ARG; proto bude muset být analýza jejich vztahu ke spotřebě antimikrobiálních látek populací popisná.

3. ETICKÉ ÚVAHY: Tento biomedicínský výzkumný projekt byl vyhodnocen Etickou komisí pro výzkum Univerzitní nemocnice Bellvitge. Bude prováděna podle předpisů Helsinské deklarace (Fortaleza, 2013). Budou použita souhrnná klinická data z databáze ministerstva zdravotnictví Katalánska. Z tohoto důvodu Etická komise upustila od požadavku informovaného souhlasu. S údaji však bude zacházeno v souladu se španělskými (organický zákon 3/2018) a evropskými (nařízení [EU) 2016/679) nařízeními.