Virkningen av luftforurensning på forbruket av antimikrobielle stoffer i den generelle befolkningen (ONAIR)

ONAIR-prosjektet vil bestå av de to delstudiene beskrevet nedenfor:

STUDIE 1

1.1 Design: En todelt tidsserieanalyse av sammenhengen mellom konsentrasjonen av de viktigste luftforurensningene (PM2.5, PM10, NO2, O3) mellom 2006 og 2022 og det daglige antimikrobielle forbruket av befolkningen generelt.

1.2 Studiens omfang og autoriserte informasjonskilder: Studien vil bli utført i de 11 byene i Catalonia med mer enn 100 000 innbyggere, fordelt på de fire provinsene i regionen. Disse byene er hjem til 3 283 501 mennesker. Daglige data om luftforurensning vil bli innhentet fra Atmospheric Pollution Monitoring and Forecasting Network (XVPCA). Daglig forbruk av antimikrobielle stoffer vil bli estimert fra de offisielle reseptdataene registrert av Council of College of Pharmacists of Catalonia (CCFC) autorisert av Department of Health i Catalonia. De sekundære kliniske variablene som studeres vil bli innhentet gjennom Agency for Quality and Health Assessment of Catalonia.

1.3 Studieemner: Voksne og barn som bor i de 11 byene som studeres.

1.4 Definisjoner: Luftforurensning. Dette er definert som påvisning av ethvert stoff i luften som kan skade helsen til mennesker, dyr eller planter, eller forårsake materiell skade. Luftforurensning kommer fra forskjellige kilder; den varierer i henhold til sammensetningen, som igjen varierer i henhold til temperaturen og fuktigheten i miljøet. For formålet med denne studien, siden ikke alle overvåkingsstasjoner for luftkvalitet registrerer data om alle forbindelsene, vil PM10, PM2.5, NO2 og 03 bli analysert. DDD (definert daglig dose). Dette er den tekniske måle- og sammenligningsenheten som tilsvarer den gjennomsnittlige daglige vedlikeholdsdosen av et legemiddel når det brukes i hovedindikasjonen via en spesifisert administreringsvei hos voksne, uttrykt i mengden av det aktive stoffet. Den er definert og oppdatert av Verdens helseorganisasjon (WHO) (https://www.whocc.no/ddd/definition_and_general_considera/#General). DDD/TID (definert døgndose per tusen innbyggere per dag). Denne parameteren er utformet for å sammenligne forbruket av legemidler uttrykt i antall DDD for forskjellige geografiske områder og/eller tidsperioder. Den beregnes ved å multiplisere antall forbrukte DDD per tusen innbyggere og dividere med antall dager i den betraktede perioden og med antall innbyggere. DDD/TID-formel = (nºP x NºF x AF x 1000) / (DDD x nº av innbyggere x nº av dager) (nºP = antall pakker utlevert daglig. NºF = antall farmasøytiske former (dvs. piller, kapsler osv.) per pakke. AP = mengde aktivt stoff per legemiddelform). Befolkningsnevner: for å beregne antall innbyggere, vil befolkningen (brukere med individuelle helsekort og tildelt et omsorgssenter) under omsorg for hver enkelt behandler bli brukt, beregnet fra dataene til primærhelsetjenestens informasjonssystem, også inkludert sykepleien hjemmebefolkning.

1.5 Beskrivelse av variablene: Hovedutfallsvariabel: definert daglig dose av antimikrobielle midler per 1000 innbyggere-dag. Hoveduavhengige variabler: konsentrasjoner av PM10, PM2,5, NO2 og 03.

Forstyrrende variabler: År, ukedag, temperatur og relativ fuktighet.

Sekundære utfallsvariabler: Definerte daglige kostnader for antimikrobielle midler per 1000 innbyggere-dag, dødelighet på grunn av naturlige årsaker, dødelighet på grunn av luftveisårsaker, sykehusinnleggelser på grunn av luftveisårsaker og konsultasjoner i primærhelsetjenesten på grunn av luftveissymptomer.

1.6 Datainnsamling: Forurensningsdata: Data om forurensning i de 11 byene som studeres fra 2006 til 2020 vil bli innhentet fra XVPCA for tidsserieanalyse. I hver luftkvalitetssone kan distinkte områder identifiseres i henhold til arealbruk (nivå 1: urbane, forstads- eller landlige områder) og type utslippskilder (nivå 2: trafikk, industri eller bakgrunn).

Tidsserien for gjennomsnittlig daglig temperatur og relativ fuktighet fra 2006 til 2020, målt av den katalanske meteorologiske tjenesten, vil bli registrert. Daglige data om forurensning, temperatur og fuktighet i disse områdene i 2021 og 2022 vil bli samlet inn prospektivt. Ukedagen og tidsserien for daglige influensatilfeller vil også bli vurdert som forvirrende variabler. Assosiasjonene av konsentrasjoner av hovedforurensningene, det daglige forbruket av antimikrobielle stoffer (DDD/TID) og de beskrevne sekundære variablene vil bli evaluert i separate analyser ved bruk av en standard tidsserietilnærming, en to-trinns analytisk protokoll som har blitt mye brukt i tidligere tidsseriestudier i mange forskjellige byer. Data om befolkning og antimikrobiell forbruk. Data vil bli samlet inn etter alder (> 65 år), kjønn og region.

For beregning av DDD/TID og utlevert kostnad/TID vil følgende daglige data samles inn etter postnummer: medikamentet (kombinasjon av virkestoff + legemiddelform + dose + antall farmasøytiske former per pakke), ATC-kode, antall utleverte pakker, utleveringsdato og offisiell pris på hver pakke. Antall brukere med individuelt helsekort og tildelt omsorgssenter vil også bli registrert.

1.7 Statistisk analyse: I det første trinnet vil assosiasjoner mellom den daglige dosen av antibiotikabehandling og de evaluerte luftforurensningene estimeres i hver by ved å bruke kvasi-Poisson generaliserte lineære modeller. Som i tidligere studier vil følgende kovariater inkluderes i hovedmodellen: året (utjevnet av kubiske splines) for å kontrollere trenden og den tidsmessige sesongvariasjonen til indikatorene; en variabel som angir ukedagen for å ta hensyn til ukentlige kortsiktige variasjoner; og temperatur (utjevnet av splines) og relativ fuktighet (utjevnet av splines) for å kontrollere potensielle ikke-lineære forvirrende effekter av været i områder der denne informasjonen er tilgjengelig. Siden den mulige effekten av et forurensende stoff på den daglige antibiotikadosen kan anslås i løpet av de påfølgende dagene, vil en rekke tidsforsinkelser bli utforsket i de estimerte modellene. Den samme prosedyren vil bli brukt på temperaturen. I det andre trinnet vil en tilfeldig effektmodell bli brukt for å metaanalysere estimater av sammenhengen mellom forurensingen og det daglige antimikrobielle forbruket oppnådd i hver by. Dermed vil det bli innhentet de samlede estimatene og deres 95 % konfidensintervaller for den prosentvise endringen i daglig antimikrobielt forbruk for hver økning på 10 μg/m3. I²-testen vil bli brukt til å evaluere heterogeniteten mellom byer. På samme måte vil modeller bli estimert for å vurdere assosiasjoner mellom sekundære utfallsvariabler og luftforurensninger. Den statistiske analysen vil bli utført ved bruk av R statistisk pakke (versjon 3.6.1 eller høyere (R Foundation for Statistical Computing) ved bruk av mgcv for hovedmodellene og rmeta for random effects modellen. Statistisk signifikans vil bli vurdert for p <0,05.

1.8 Begrensninger: En mulig begrensning kan være vanskeligheten med å skille mellom virkningen av forurensning på antibiotikaforbruket som en direkte årsak-virkning-sammenheng eller som en forvirrende faktor i årsak-virkning-forholdet mellom luftforurensning og respiratoriske eksacerbasjoner av tidligere patologi.

STUDIE 2

2.1 Design: Deskriptiv observasjonsstudie av konsentrasjonen av antibiotikaresistensgener (ARG) i området Barcelona i perioden 2021-2023. Forskjellene mellom konsentrasjonen av disse genene ved en luftkvalitetsovervåkingsstasjon nær et sykehus og på en annen stasjon andre steder i byen, vil bli evaluert, så vel som mellomsesongens og mellommånedlige forskjeller. Tilstedeværelsen av visse resistensgener vil bli vurdert i forhold til forbruket av visse grupper av antimikrobielle stoffer i studiepopulasjonen.

2.2 Studiens omfang og informasjonskilder: Studien vil bli utført i byen Barcelona. Luftforurensningsprøvene vil bli innhentet for analyse fra tre av XVPCAs luftkvalitetsovervåkingsstasjoner: en av dem i sentrum hvor det er et betydelig trafikkvolum, og den andre ligger nær et sykehus på tredje nivå.

2.3 Studieemner: Voksne og barn som bor i byen Barcelona.

2.4 Definisjoner: ARG (antibiotikaresistensgen): fragmentet av genomet til en mikroorganisme som koder for antimikrobielle resistensmekanismer. Mikroorganismer kan tilegne seg ARG-er enten via arv eller gjennom horisontal overføring av gener fra andre mikroorganismer. Luftforurensning: se definisjon i delprosjekt 1, pkt. 1.4.

2.5 Studievariabler: Hovedutfallsvariabel: Konsentrasjon av antibiotikaresistensgener/måned. Uavhengig hovedvariabel: definert daglig dose av antimikrobielle stoffer per 1000 innbyggere-dag.

2.6 Innsamling: Prøvetaking: Prøver fra filtrene som brukes til å måle PM-konsentrasjoner vil bli samlet inn på tre stasjoner i XVPCA sone 1, tilsvarende byen Barcelona. Prøver vil bli samlet inn på to stasjoner som er representativt for urban trafikkrelatert forurensning (Plaça Universitat og Poble Nou) og på en annen stasjon som er representativ for et sykehusområde (Parc de Vall D'Hebron). Prøvetakingen vil finne sted den første tirsdagen i hver måned. På denne måten vil det bli foretatt tre månedlige målinger over til sammen 30 måneder, så det blir samlet inn 90 prøver. Dersom det er en episode med høy forurensning i løpet av studien, vil ekstra prøvetaking bli vurdert. Meteorologiske data tilsvarende hver måledag vil også bli registrert.

Prøvebehandling: Prøver vil bli samlet inn gjennom Pallflex høyvolum (30m3) kvartsfiberfiltre (15 cm i diameter). Før bruk vil filtrene steriliseres ved 205°C i 5 timer og kondisjoneres i 48 timer ved 20°C og 50 % relativ fuktighet. Hvert filter veies tre ganger hver 24. time i en mikrovekt med 1 g følsomhet. Etter prøvetaking vil filtrene bli tatt med til mikrobiologilaboratoriet hvor prøver av PM2.5 tas ut, som følger. Først vil filteret kuttes med en sterilisert kutter. Deretter tilsettes hvert filterfragment til 2mL sterilt renset vann med 0,05 % Tween 20-løsning i et sterilt sentrifugekar; deretter vil en 20 minutters sonikering bli utført etterfulgt av 40 minutter med virvelrøring ved 2800 rpm. PM2.5-prøvene vil bli lagret ved -20ºC til de er endelig behandlet. DNA-ekstraksjon og haglesekvensering av mikrobiell DNA: Fra den oppnådde fortynningen vil 1mg/mL ekstraheres. DNA-ekstraksjon vil bli utført automatisk ved bruk av KingFisher (ThermoFisher) utstyr med MagMaxTM Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation (ThermoFisher) kit. Bibliotekene vil bli bygget ved hjelp av Illumina Nextera-XT®-settet.

Sekvensering vil bli gjort 2x150bp på en NextSeq550® fra Illumina. Kvaliteten på sekvensene vil bli analysert med FastQC1-programmet og den tilsvarende filtreringen vil bli utført med Trimmomatic2-programmet. Menneskelig forurensning vil bli eliminert ved å kartlegge sekvensene filtrert mot det menneskelige genomet med Bowtie 23-programmet. Metaphlan v24-programvaren vil bli brukt til å utlede den mikrobielle sammensetningen. For å studere resistomet vil de ervervede antibiotikaresistensgenene og kromosompunktmutasjonene bli identifisert med ResFinder 3.05. Befolkningsdata og antimikrobielle forbruksdata: Disse dataene vil bli samlet inn på samme måte som beskrevet for delprosjekt 1 (se avsnitt), men i Barcelona-området, og spesifikt i postnumrene som tilsvarer områdene hvor metagenomiske data samles inn.

2.7 Statistisk analyse: Det vil bli laget varmekart for den relative forekomsten av ARG basert på forskjellene til 2-ΔCT. En nettverksanalyse vil bli utført basert på Spearmans rangkorrelasjoner for å visualisere sammenfall av ARG-subtyper i luften og i bakteriesamfunn. ARG-konsentrasjonene i ulike måneder og sesonger vil bli sammenlignet ved bruk av boksplott. I tillegg vil det bli laget en Pearson-korrelasjon for å relatere konsentrasjonen av ARG til forbruket av antimikrobielle midler i områdene som studeres. For å vurdere rikdommen og mangfoldet til bakteriesamfunnet, vil alfa-diversiteten beregnes ved hjelp av Mothur 1.30.1 i samsvar med litteraturen (Schloss et al, 2009) for et konfidensnivå på 95 %. Den statistiske analysen vil bli utført ved bruk av R statistisk pakke versjon 3.6.1 eller høyere (R Foundation for Statistical Computing).

2.8 Begrensninger: Hovedbegrensningen for denne delstudien er dens beskrivende karakter. Tidsperioden som studeres tillater ikke etablering av direkte tidsmessige forhold mellom graden av luftforurensning og konsentrasjonen av ARG på en bestemt dag. I tillegg, på grunn av kompleksiteten til teknikken, kan bare et begrenset antall ARG-bestemmelser utføres; derfor vil analysen av deres forhold til befolkningens forbruk av antimikrobielle stoffer måtte være beskrivende.

3. ETISKE HENSYN: Dette biomedisinske forskningsprosjektet er evaluert av Forskningsetisk komité ved Bellvitge universitetssykehus. Det vil bli utført under forskriftene fra Helsinki-erklæringen (Fortaleza, 2013). Samlede kliniske data fra databasen til Department of Health of Catalonia vil bli brukt. Av denne grunn er kravet om informert samtykke frafalt av Etikkkomiteen. Ikke desto mindre vil dataene bli behandlet i samsvar med spansk (organisk lov 3/2018) og europeisk (forordning [EU) 2016/679) forskrifter.