Hodnocení bezpečnosti a snášenlivosti kombinace dvou induktorů HIV u pacientů s nedetekovatelnou virovou zátěží (SYNACTHIV)

Kombinovaná antiretrovirová terapie (cART) je účinná, ale ne kurativní. cART vyžaduje celoživotní dodržování. Ačkoli může existovat více rezervoárů, mezi infikovanými CD4+ T buňkami převládají rezervoáry HIV-1 obsahující stabilně integrované, transkripčně tiché, ale replikačně kompetentní proviry. Jsou proto trvalým zdrojem reaktivace viru a mohly by být zodpovědné za obnovení plazmatické virémie pozorované po přerušení cART. Přetrvávání skutečně latentního (tj. nedefektní) HIV-1 proviry představují hlavní překážku eradikace, jak naznačuje selhání intenzifikačních strategií cART při čištění virových rezervoárů. Hladiny rezervoárů HIV-1 se skutečně jeví jako jeden z kritických faktorů ovlivňujících dobu trvání remise po ukončení cART 4. V důsledku toho pokles velikosti latentních rezervoárů HIV-1 na úroveň dostatečnou pro účinnou kontrolu infekce imunitním systémem hostitele může umožnit přerušení terapie ("okna bez léčby"). Reaktivace exprese HIV genu v latentně infikovaných buňkách spolu s účinnou nebo zesílenou cART by mohla sloužit jako adjuvantní terapie zaměřená na eliminaci/snížení zásoby latentních virových rezervoárů.

Organizace chromatinu a epigenetická kontrola promotoru HIV-1 jsou klíčovými prvky zapojenými do umlčování transkripce. Represivní nukleozom nuc-1, umístěný bezprostředně po směru transkripčního startovacího místa, je udržován hypoacetylovaný histondeacetylázami (HDAC) v latentních podmínkách. Použití inhibitorů HDAC (HDACis) jako činidel reverzujících latenci (LRA) bylo dobře charakterizováno v několika modelech latence a in vivo na buněčných kulturách HIV-1+ pacientů léčených cART. Bylo hlášeno několik klinických studií a studií využívajících HDACis [VPA (od Margolis, Siliciano, Lambotte a Routy), SAHA (od Margolis a od Lewina), Panobinostat (od Rasmussen) a romidepsin (od Mellors (ClinicalTrials.gov NCT01933594) a Sogaard)]. Předchozí studie testující VPA neprokázaly žádný přínos tohoto HDACi při snižování počtu latentně infikovaných klidových CD4+ T buněk. Dvě klinické studie prokázaly, že podávání jedné nebo více klinicky tolerovatelných dávek SAHA pacientům léčeným cART bylo dočasně spojeno se zvýšením exprese hladin buněčně asociované nesestříhané (CA-US) HIV-1 RNA v klidovém CD4+ T buňky in vivo. Obě studie však neprokázaly ani zvýšení reziduální virémie, ani snížení velikosti rezervoárů HIV-1. Další nedávná pilotní klinická studie s HDACi Panobinostatem prokázala významné zvýšení hladin CA-US RNA, ale také zvýšení hladiny genomové RNA HIV v plazmě analyzované testem amplifikace zprostředkované transkripcí (TMA), jakož i přechodné snížení celkového množství HIV. úroveň DNA. Po přerušení cART tato druhá studie ukázala u některých pacientů návrat virové zátěže, který byl opožděný ve srovnání s návratem pozorovaným u většiny pacientů 2-3 týdny po ukončení cART. Výsledky z jiné nedávné pilotní klinické studie zahrnující intravenózní injekci romidepsinu, podávanou jednou týdně po dobu 3 týdnů při zachování cART, ukázaly, že 5 ze 6 testovaných aviremických pacientů vykazovalo úrovně virové zátěže kvantifikovatelné standardními komerčními testy. Celkově jsou tyto studie povzbudivé, ale zpochybňují účinnost samotného HDACi ke snížení velikosti rezervoárů HIV-1 nebo ke sledování zpoždění virového reboundu. Vyšetřovatelé navrhují některé hypotézy, aby vysvětlili tyto dílčí výsledky a některé optimalizace pro zlepšení terapeutických reaktivačních strategií:

1. Úroveň reaktivace dosažená v těchto klinických studiích byla příliš nízká. Současné zacílení na různé mechanismy latence by mělo být účinnější, když je cílem virová eradikace, protože kombinace různých tříd sloučenin by mohla synergizovat (tj. výsledkem je vyšší úroveň reaktivace, než je součet reaktivací produkovaných každou sloučeninou jednotlivě), aby se reaktivovala exprese HIV v latentně infikovaných buňkách.
2. Může být zapotřebí přesný časový rozvrh pro podávání LRA, což naznačuje, že sekvenční léčba by mohla zlepšit účinek podávání dvou LRA zaměřených na různé mechanismy latence.
3. Latence HIV-1 je heterogenní jev. Výzkumníci již dříve v našich reaktivačních studiích prováděných ex vivo pozorovali vysokou diverzitu mezi buněčnými kulturami pacientů, pokud jde o vzorec odpovědí na různé testované LRA. Tato zjištění naznačují, že represe transkripce HIV-1 je výsledkem heterogenních kombinací molekulárních mechanismů, které se liší od jednoho pacienta k druhému. Heterogenita, kterou výzkumníci pozorovali mezi pacienty, zdůrazňuje potřebu vyhodnotit účinnost LRA nejprve ex vivo v buněčných kulturách od daného pacienta před podáním této LRA tomuto danému pacientovi in ​​vivo v kontextu klinické studie. Bohužel v naprosté většině předchozích klinických studií zaměřených na reaktivaci HIV-1 z latence nebyla provedena předvýběr na základě ex vivo reaktivačních testů.
4. Indukce genové exprese latentních provirů HIV je stochastická. Silicianova skupina skutečně ukázala, že po jednom kole in vitro maximální aktivace T-buněk některé proviry zůstávají tiché, ale jsou potenciálně indukovatelné po dalších kolech aktivace. Aby se maximalizovala aktivita daného LRA, měl by být tedy podáván opakovaně ve více časových bodech.

V důsledku toho by optimalizace „šokové“ části, první části strategie „šok a zabití“, zahrnovala individualizovanou a kombinovanou léčbu LRA, podávanou s přesným časovým rozvrhem a opakovaně v několika časových bodech. Za účelem vytvoření takového typu klinické studie vyšetřovatelé zkoumali in vitro a ex vivo několik typů kombinací LRA. Jeden z nich měl několik výhod a byl schválen v humánní terapii.

Epigeneticky je skutečně známo, že methylace DNA a deacetylace histonů spolupracují na vytvoření a udržení heterochromatinového prostředí. Proteiny MethylBinding Domain (MBD) navázané na methylovanou DNA v oblastech cis-regulátorů mohou skutečně sloužit jako mosty mezi DNA a faktory modifikujícími chromatin (jako jsou HDAC). V případě HIV bylo dříve prokázáno, že promotor HIV-1 je hypermethylovaný ex vivo a odolný vůči reaktivaci v latentních rezervoárech od aviremických jedinců infikovaných HIV-1, na rozdíl od hypomethylovaného 5'LTR integrovaných provirů přítomných ve viremických pacientů. Zajímavé je, že Trejbalová a spol. nedávno uvedli, že methylace DNA promotoru HIV-1 se během léčby cART progresivně zvyšuje. Tito autoři skutečně detekovali nízké hladiny methylace 5' LTR DNA v klidových CD4+ T buňkách pacientů, kteří byli léčeni cART po dobu až 3 let. Po dlouhodobé cART však pozorovali akumulaci methylace 5' LTR DNA v latentním rezervoáru. Stav metylace DNA promotoru HIV-1 by mohl přispět k „uzamknutí“ tichého stavu proviru ve spolupráci s posttranslačními modifikacemi represivními na histony, jako je deacetylace histonů, čímž by byl návrat proviru do aktivního stavu obtížnější. Z tohoto pohledu by demetylační látky mohly představovat slibné kandidátní léky v kombinaci s HDACis pro snížení množství latentních rezervoárů HIV u pacientů pod cART po dobu alespoň 3 let.

Navíc je známo, že dvě epigenetické modifikace, methylace DNA a deacetylace histonů, jsou dynamicky propojeny a vedou k umlčování genů u rakoviny. Několik preklinických studií skutečně podporuje názor, že farmakologické cílení DNMT i HDAC může vést k synergické protirakovinné aktivitě. Kromě toho probíhají dvě klinické studie s inhibitorem methylace DNA Decitabinem a HDACi romidepsinem v léčbě rakoviny (NCT00037817, NCT00114257). Inhibitor methylace DNA Decitabin schválený v lidské terapii a HDAC představují několik výhod pro strategie odstraňování HIV-1. Decitabin představuje tu výhodu, že prochází hematoencefalickou bariérou, má vynikající distribuci v tělesných tekutinách a neindukuje globální aktivaci T-buněk. HDAC neindukují globální proliferaci nebo aktivaci T-buněk, působí v širokém spektru buněčných typů a silně potlačují expresi a funkci chemokinového receptoru CXCR4. HDAC byly také identifikovány jako nové látky uvolňující P-TEFb. Toto je nepochybně další zásadní mechanismus, kterým HDAC reaktivují expresi HIV. Přechod z proximální pauzy promotoru k produktivní elongaci je skutečně zprostředkován virovým trans-aktivátorem Tat a P-TEFb, základním buněčným elongačním transkripčním faktorem. V buňkách existuje P-TEFb v aktivní a neaktivní formě. Jeho uvolnění z neaktivního 7SK malého jaderného ribonukleoproteinového komplexu je kritickým krokem pro P-TEFb k aktivaci transkripčního prodloužení. Proto je důležité, že použití těchto dvou léků může ovlivnit další mechanismy (jiné než acetylace histonů a metylace DNA), které se podílejí na latenci HIV.

1.2 Výzkumná hypotéza Nedávno naše laboratoř hodnotila terapeutický potenciál demetylačních činidel v kombinaci s HDACis při reaktivaci HIV z latence in vitro a ex vivo. HIV-1 reaktivační potenciál LRA byl hodnocen nejprve in vitro ve dvou latentně infikovaných T-buněčných liniích (kvantifikací HIV-1 transkripce, exprese a produkce) a následně ex vivo v CD8+-depletovaných PBMC a klidových CD4+ T-buněčných kulturách od 58 aviremických HIV-1+ pacientů léčených cART (kvantifikací produkce HIV-1). Výzkumníci prokázali, že inhibitor methylace DNA 5-aza-2'deoxycytidin (Decitabin), ale nikoli 5-azacytidin, indukoval expresi HIV in vitro. Výzkumníci dále in vitro prokázali, že sekvenční léčba decitabinem + HDAC se používá v klinicky tolerovatelných dávkách synergicky indukovaných expresi HIV, což poprvé zdůraznilo důležitost léčebného plánu pro kombinované léčby LRA. Důležité je, že výzkumníci prokázali fyziologickou relevanci této synergie a sekvenčního aspektu ex vivo. Je zajímavé, že testovaná sekvenční kombinovaná léčba decitabinem + romidepsinem indukovala obnovu HIV-1 vyšším způsobem než samotná léčiva v kulturách PBMC s ochuzeným CD8+. Na závěr výzkumníci poprvé uvedli, že kromě kombinačního aspektu může být sekvenční aspekt podávání LRA kritický pro strategie čištění zaměřené na snížení velikosti rezervoáru.

Vyšetřovatelé předpokládají, že takové sekvenční kombinační reaktivační přístupy by mohly vést k poklesu velikosti rezervoáru HIV-1 na úroveň dostatečnou pro kontrolu infekce HIV imunitním systémem hostitele a doufejme, že k terapeutickým přerušením. Prvním krokem ke zdůraznění přínosu tohoto typu intervence je však vyhodnocení proveditelnosti, bezpečnosti a snášenlivosti takových sekvenčních kombinovaných reaktivačních přístupů.

V důsledku toho, na základě našich výsledků ex vivo a na základě námi navrhovaných optimalizací části „šok“, první části strategie „šok a zabití“ (zahrnující individualizovanou a kombinovanou léčbu LRA, podávanou podle přesného časového rozvrhu a opakovaně při více časových bodů), výzkumníci navrhují zavést studii fáze I u HIV-1 podtypu B pozitivních pacientů v rámci cART po dobu alespoň 48 měsíců a vykazující, podle nejlepších znalostí klinických PI, žádný detekovatelný virový výkyv pro alespoň 12 měsíců za účelem vyhodnocení proveditelnosti, bezpečnosti a snášenlivosti sekvenční léčby decitabinem v kombinaci s romidepsinem podávaným v několika časových bodech [jednou (skupina 1), dvakrát (kohorta 2) nebo čtyřikrát (kohorta 3)] . Sekundárním cílem bude také hodnocení dopadu kombinované léčby (decitabin + romidepsin) na virové rezervoáry a expresi genu HIV.