Valutazione della sicurezza e della tollerabilità di una combinazione di due induttori dell'HIV in pazienti con carica virale non rilevabile (SYNACTHIV)

La terapia antiretrovirale di combinazione (cART) è potente ma non curativa. cART richiede l’adesione per tutta la vita. Sebbene possano esistere più serbatoi, è noto che i serbatoi dell'HIV-1 contenenti provirus stabilmente integrati, trascrizionalmente silenziosi ma competenti per la replicazione predominano tra le cellule T CD4+ infette. Sono quindi una fonte permanente di riattivazione del virus e potrebbero essere responsabili del rimbalzo della viremia plasmatica osservato dopo l’interruzione della cART. Persistenza di elementi veramente latenti (es. non difettosi) i provirus HIV-1 rappresentano un grave ostacolo all’eradicazione, come suggerito dal fallimento delle strategie di intensificazione della cART nel eliminare i serbatoi virali. In effetti, i livelli dei serbatoi dell’HIV-1 appaiono come uno dei fattori critici che influenzano la durata di una remissione dopo la sospensione della cART 4. Di conseguenza, un declino delle dimensioni dei serbatoi latenti dell’HIV-1 a un livello sufficiente a consentire un controllo efficiente del l'infezione da parte del sistema immunitario ospite potrebbe consentire interruzioni della terapia ("finestre prive di trattamento"). La riattivazione dell’espressione del gene dell’HIV nelle cellule latentemente infette insieme a un cART efficiente o intensificato potrebbe servire come terapia adiuvante mirata a eliminare/diminuire il pool di serbatoi virali latenti.

L'organizzazione della cromatina e il controllo epigenetico del promotore dell'HIV-1 sono elementi chiave coinvolti nel silenziamento trascrizionale. Il nucleosoma repressivo nuc-1, situato immediatamente a valle del sito di inizio della trascrizione, è mantenuto ipoacetilato dalle istone deacetilasi (HDAC) in condizioni latenti. L'uso degli inibitori dell'HDAC (HDACi) come agenti di inversione della latenza (LRA) è stato ben caratterizzato in diversi modelli di latenza e in colture cellulari di pazienti HIV-1+ trattate con cART ex vivo. Sono stati riportati numerosi studi clinici e sperimentazioni che utilizzano gli HDAC [VPA (di Margolis, Siliciano, Lambotte e Routy), SAHA (di Margolis e Lewin), Panobinostat (di Rasmussen) e romidepsin (di Mellors (ClinicalTrials.gov NCT01933594) e Sogaard)]. Gli studi precedenti che hanno testato il VPA non hanno mostrato alcun beneficio da questo HDACi nel ridurre il numero di cellule T CD4+ riposanti latentemente infette. Due studi clinici hanno dimostrato che la somministrazione a pazienti trattati con cART di una o più dosi clinicamente tollerabili di SAHA era temporaneamente associata ad un aumento dell'espressione dei livelli di RNA HIV-1 cell-associated unspliced ​​(CA-US) all'interno dei CD4+ riposanti. Cellule T in vivo. Tuttavia, entrambi gli studi non hanno potuto mostrare né un aumento della viremia residua né una diminuzione delle dimensioni dei serbatoi dell’HIV-1. Un altro recente studio clinico pilota con il Panobinostat HDACi ha mostrato un aumento significativo dei livelli di CA-US RNA ma anche un aumento del livello plasmatico di RNA genomico dell'HIV analizzato mediante un test di amplificazione mediata dalla trascrizione (TMA), nonché una diminuzione transitoria dell'HIV totale Livello del DNA. Dopo l’interruzione della cART, quest’ultimo studio ha mostrato in alcuni pazienti un rimbalzo della carica virale che è stato ritardato rispetto al rimbalzo osservato nella maggior parte dei pazienti 2-3 settimane dopo l’interruzione della cART. I risultati di un altro recente studio clinico pilota che prevedeva l’iniezione endovenosa di romidepsina, somministrata una volta alla settimana per 3 settimane mantenendo la cART, hanno dimostrato che 5 pazienti aviremici su 6 testati presentavano livelli di carica virale quantificabili mediante test commerciali standard. Nel complesso, questi studi sono incoraggianti, ma mettono in dubbio l’efficienza degli HDACi usati da soli per ridurre le dimensioni dei serbatoi dell’HIV-1 o per osservare un ritardo nel rimbalzo virale. I ricercatori propongono alcune ipotesi per spiegare questi risultati parziali e alcune ottimizzazioni per migliorare le strategie di riattivazione terapeutica:

1. Il livello di riattivazione ottenuto in questi studi clinici era troppo debole. Mirare simultaneamente a diversi meccanismi di latenza dovrebbe essere più efficiente quando l’obiettivo è l’eradicazione virale poiché la combinazione di diverse classi di composti potrebbe creare sinergia (ad es. comportano un livello di riattivazione più elevato rispetto alla somma delle riattivazioni prodotte da ciascun composto individualmente) per riattivare l'espressione dell'HIV nelle cellule latentemente infette.
2. Potrebbe essere necessario un programma temporale preciso per la somministrazione di LRA, suggerendo che un trattamento sequenziale potrebbe migliorare l’effetto della somministrazione di due LRA mirati a diversi meccanismi di latenza.
3. La latenza dell’HIV-1 è un fenomeno eterogeneo. Infatti, i ricercatori hanno precedentemente osservato nei nostri studi di riattivazione eseguiti ex vivo un'elevata diversità tra le colture cellulari dei pazienti in termini di modello di risposta ai diversi LRA testati. Questi risultati suggeriscono che la repressione trascrizionale dell'HIV-1 deriva da combinazioni eterogenee di meccanismi molecolari che variano da un paziente all'altro. L’eterogeneità che i ricercatori hanno osservato tra i pazienti sottolinea la necessità di valutare l’efficacia di un LRA ex vivo in colture cellulari di un dato paziente prima della somministrazione di questo LRA a questo dato paziente in vivo nel contesto di uno studio clinico. Sfortunatamente, nella stragrande maggioranza dei precedenti studi clinici volti a riattivare l’HIV-1 dalla latenza, non è stata effettuata una preselezione basata su test di riattivazione ex vivo.
4. L'induzione dell'espressione genica dei provirus HIV latenti è stocastica. Infatti, il gruppo di Siliciano ha dimostrato che dopo un ciclo di massima attivazione delle cellule T in vitro, alcuni provirus rimangono silenziosi ma sono potenzialmente inducibili dopo ulteriori cicli di attivazione. Per massimizzare l’attività di una determinata LRA, questa dovrebbe quindi essere somministrata ripetutamente in più momenti.

Di conseguenza, un'ottimizzazione della parte "shock", prima parte della strategia "shock and kill", comporterebbe un trattamento individualizzato e combinato degli LRA, somministrato con un programma temporale preciso e ripetutamente in più punti temporali. Per impostare questo tipo di sperimentazione clinica, i ricercatori hanno studiato in vitro ed ex vivo diversi tipi di combinazioni di LRA. Uno di questi presentava numerosi vantaggi ed è stato approvato nella terapia umana.

Infatti, dal punto di vista epigenetico, è noto che la metilazione del DNA e la deacetilazione degli istoni cooperano per stabilire e mantenere un ambiente di eterocromatina. Infatti, le proteine ​​MethylBinding Domain (MBD) legate al DNA metilato nelle regioni cis-regolatrici possono fungere da ponti tra il DNA e i fattori che modificano la cromatina (come gli HDAC). Nel caso dell'HIV, è stato precedentemente dimostrato che il promotore dell'HIV-1 è ipermetilato ex vivo e resistente alla riattivazione nei serbatoi latenti di individui aviremici infetti da HIV-1, in contrapposizione al 5'LTR ipometilato dei provirus integrati presenti nell'HIV-1 pazienti. È interessante notare che Trejbalova et al. hanno recentemente riportato che la metilazione del DNA del promotore dell'HIV-1 aumenta progressivamente durante il trattamento con cART. Infatti, questi autori hanno rilevato bassi livelli di metilazione del DNA 5' LTR nelle cellule T CD4+ riposanti di pazienti trattati con cART per un massimo di 3 anni. Tuttavia, dopo cART a lungo termine, hanno osservato un accumulo di metilazione del DNA 5' LTR nel serbatoio latente. Lo stato di metilazione del DNA del promotore dell'HIV-1 potrebbe contribuire a "bloccare" lo stato silente del provirus in cooperazione con modificazioni post-traduzionali repressive degli istoni come la deacetilazione dell'istone, rendendo così più difficile il ritorno del provirus a uno stato attivo. In questa prospettiva, gli agenti demetilanti potrebbero rappresentare farmaci candidati promettenti in combinazione con HDAC per ridurre il pool di serbatoi latenti di HIV dei pazienti sottoposti a cART per almeno 3 anni.

Inoltre, è noto che le due modificazioni epigenetiche, la metilazione del DNA e la deacetilazione degli istoni, sono dinamicamente collegate e determinano il silenziamento dei geni nei tumori. In effetti, diversi studi preclinici supportano l’ipotesi che il targeting farmacologico sia del DNMT che dell’HDAC possa comportare un’attività antitumorale sinergica. Inoltre, sono in corso due studi clinici con l'inibitore della metilazione del DNA Decitabina e la romidepsina HDACi nella terapia del cancro (NCT00037817, NCT00114257). L’inibitore della metilazione del DNA Decitabina approvato nella terapia umana e gli HDAC presentano numerosi vantaggi per le strategie di eliminazione dell’HIV-1. La decitabina presenta il vantaggio di attraversare la barriera ematoencefalica, di possedere un'ottima distribuzione nei liquidi corporei, di non indurre l'attivazione globale delle cellule T. Gli HDAC non inducono la proliferazione o l'attivazione globale delle cellule T, agiscono in un ampio spettro di tipi cellulari e reprimono potentemente l'espressione e la funzione del recettore delle chemochine CXCR4. Gli HDAC sono stati identificati anche come nuovi agenti di rilascio di P-TEFb. Questo è senza dubbio un altro meccanismo cruciale attraverso il quale gli HDAC riattivano l’espressione dell’HIV. Infatti, il passaggio dalla pausa prossimale del promotore all’allungamento produttivo è mediato dal trans-attivatore virale Tat e P-TEFb, un fattore di trascrizione essenziale dell’allungamento cellulare. Nelle cellule, P-TEFb esiste in forme attive e inattive. Il suo rilascio dal piccolo complesso ribonucleoproteico nucleare inattivo 7SK è un passaggio fondamentale affinché P-TEFb attivi l'allungamento della trascrizione. Pertanto, è importante sottolineare che l’uso dei due farmaci potrebbe avere un impatto su altri meccanismi (diversi dall’acetilazione degli istoni e dalla metilazione del DNA) coinvolti nella latenza dell’HIV.

1.2 Ipotesi di ricerca Recentemente, il nostro laboratorio ha valutato il potenziale terapeutico degli agenti demetilanti in combinazione con HDAC nella riattivazione dell'HIV dalla latenza in vitro ed ex vivo. Il potenziale di riattivazione dell'HIV-1 degli LRA è stato valutato prima in vitro in due linee di cellule T latentemente infette (mediante quantificazione della trascrizione, espressione e produzione dell'HIV-1) e successivamente ex vivo in PBMC deplete di CD8+ e colture di cellule T CD4+ riposanti da 58 pazienti HIV-1+ aviremici trattati con cART (mediante quantificazione della produzione di HIV-1). I ricercatori hanno dimostrato che l'inibitore della metilazione del DNA 5-aza-2'deossicitidina (Decitabina), ma non la 5-azacitidina, ha indotto l'espressione dell'HIV in vitro. I ricercatori hanno poi dimostrato in vitro che un trattamento sequenziale di Decitabina + HDAC utilizzato a dosi clinicamente tollerabili induce sinergicamente l'espressione dell'HIV, evidenziando per la prima volta l'importanza di un programma di trattamento per i trattamenti combinati con LRA. È importante sottolineare che i ricercatori hanno dimostrato la rilevanza fisiologica di questa sinergia e dell'aspetto sequenziale ex vivo. È interessante notare che il trattamento combinato sequenziale decitabina + romidepsina testato ha indotto il recupero dell'HIV-1 in modo più elevato rispetto ai farmaci da soli nelle colture di PBMC deplete di CD8+. In conclusione, i ricercatori hanno riferito per la prima volta che, oltre all’aspetto combinatorio, l’aspetto sequenziale della somministrazione dell’LRA potrebbe essere fondamentale per le strategie di spurgo volte a ridurre le dimensioni del giacimento.

I ricercatori ipotizzano che tali approcci di riattivazione combinatoria sequenziale potrebbero portare a una diminuzione delle dimensioni del serbatoio dell'HIV-1 a un livello sufficiente per consentire il controllo dell'infezione da HIV da parte del sistema immunitario ospite e, si spera, interruzioni terapeutiche. Tuttavia, il primo passo per evidenziare il beneficio di questo tipo di intervento è valutare la fattibilità, la sicurezza e la tollerabilità di tali approcci di riattivazione combinatoria sequenziale.

Di conseguenza, sulla base dei nostri risultati ex vivo e delle nostre proposte di ottimizzazione della parte "shock", prima parte della strategia "shock and kill", (che prevede un trattamento individualizzato e combinato degli LRA, somministrato con un programma temporale preciso e ripetutamente a più punti temporali), i ricercatori propongono di avviare uno studio di fase I in pazienti positivi all'HIV-1 sottotipo B sottoposti a cART per almeno 48 mesi e che non presentino, per quanto a conoscenza dei PI clinici, alcun blip virale rilevabile per un periodo almeno 12 mesi al fine di valutare la fattibilità, la sicurezza e la tollerabilità di un trattamento sequenziale di decitabina in combinazione con romidepsin somministrato in più punti temporali [una volta (coorte 1), due volte (coorte 2) o quattro volte (coorte 3)] . Come obiettivo secondario, i ricercatori valuteranno anche l'impatto del trattamento combinato (decitabina + romidepsina) sui serbatoi virali e sull'espressione genica dell'HIV.