Ocena bezpieczeństwa i tolerancji połączenia dwóch induktorów wirusa HIV u pacjentów z niewykrywalnym wiremią (SYNACTHIV)

Skojarzona terapia przeciwretrowirusowa (cART) jest skuteczna, ale nie lecznicza. cART wymaga przestrzegania zaleceń przez całe życie. Chociaż może istnieć wiele rezerwuarów, uznaje się, że wśród zakażonych limfocytów T CD4+ dominują rezerwuary HIV-1 zawierające stabilnie zintegrowane, ciche transkrypcyjnie, ale kompetentne prowirusy. Są zatem stałym źródłem reaktywacji wirusa i mogą być odpowiedzialne za odbicie wiremii osocza obserwowane po przerwaniu stosowania cART. Trwałość prawdziwie utajonych (tj. niedefektywne) prowirusy HIV-1 stanowią główną przeszkodę w eradykacji, jak sugeruje niepowodzenie strategii intensyfikacji cART w usuwaniu rezerwuarów wirusa. Rzeczywiście, poziom rezerwuarów wirusa HIV-1 wydaje się być jednym z kluczowych czynników wpływających na czas trwania remisji po zaprzestaniu stosowania cART. 4. W konsekwencji zmniejszenie wielkości zbiorników utajonego wirusa HIV-1 do poziomu wystarczającego do umożliwienia skutecznej kontroli zakażenie układu odpornościowego gospodarza może spowodować przerwy w leczeniu („okna wolne od leczenia”). Reaktywacja ekspresji genu HIV w komórkach zakażonych latentnie wraz ze skutecznym lub zintensyfikowanym cART może służyć jako terapia uzupełniająca mająca na celu wyeliminowanie/zmniejszenie puli utajonych rezerwuarów wirusa.

Organizacja chromatyny i epigenetyczna kontrola promotora HIV-1 to kluczowe elementy zaangażowane w wyciszanie transkrypcji. Represyjny nukleosom nuc-1, znajdujący się bezpośrednio poniżej miejsca startu transkrypcji, jest utrzymywany w stanie hipoacetylowanym przez deacetylazy histonowe (HDAC) w warunkach utajonych. Zastosowanie inhibitorów HDAC (HDACis) jako środków odwracających latencję (LRA) zostało dobrze scharakteryzowane w kilku modelach latencji i hodowlach komórkowych pacjentów HIV-1+ leczonych ex vivo cART. Doniesiono o kilku badaniach klinicznych i próbach z użyciem HDACis [VPA (autor: Margolis, Siliciano, Lambotte i Routy), SAHA (autor: Margolis i Lewin), Panobinostat (autor: Rasmussen) i romidepsyna (autor: Mellors (ClinicalTrials.gov NCT01933594) i Sogaard)]. Poprzednie badania testujące VPA nie wykazały żadnych korzyści ze stosowania tego HDACi w zmniejszaniu liczby utajonych zakażonych spoczynkowych limfocytów T CD4+. Dwa badania kliniczne wykazały, że podanie pacjentom leczonym cART jednej lub wielu klinicznie tolerowanych dawek SAHA było przejściowo związane ze wzrostem ekspresji poziomów RNA HIV-1 związanego z komórkami (CA-US) w spoczynkowym CD4+. Komórki T in vivo. Jednakże w obu badaniach nie wykazano ani wzrostu wiremii resztkowej, ani zmniejszenia wielkości rezerwuarów wirusa HIV-1. Inne niedawne pilotażowe badanie kliniczne z użyciem HDACi Panobinostat wykazało znaczny wzrost poziomu RNA CA-US, ale także wzrost poziomu genomowego RNA HIV w osoczu, analizowanego za pomocą testu amplifikacji za pośrednictwem transkrypcji (TMA), jak również przejściowe zmniejszenie całkowitego wirusa HIV Poziom DNA. Po przerwaniu stosowania cART to ostatnie badanie wykazało u niektórych pacjentów odbicie miana wirusa, które było opóźnione w porównaniu z odbiciem obserwowanym u większości pacjentów 2-3 tygodnie po zaprzestaniu stosowania cART. Wyniki innego niedawnego pilotażowego badania klinicznego obejmującego dożylne wstrzyknięcie romidepsyny podawanej raz w tygodniu przez 3 tygodnie przy jednoczesnym utrzymaniu cART, wykazały, że u 5 z 6 badanych pacjentów z awiremią poziom wiremii był mierzalny za pomocą standardowych testów komercyjnych. W sumie badania te są zachęcające, ale kwestionują skuteczność HDACi stosowanego samodzielnie w zmniejszaniu wielkości rezerwuarów HIV-1 lub obserwowaniu opóźnienia w odbiciu wirusa. Badacze proponują pewne hipotezy w celu wyjaśnienia tych częściowych wyników oraz pewne optymalizacje w celu ulepszenia strategii reaktywacji terapeutycznej:

1. Poziom reaktywacji uzyskany w tych badaniach klinicznych był zbyt słaby. Jednoczesne ukierunkowanie na różne mechanizmy latencji powinno być bardziej skuteczne, gdy celem jest eradykacja wirusa, ponieważ połączenie różnych klas związków mogłoby działać synergicznie (tj. powodują wyższy poziom reaktywacji niż suma reaktywacji wytwarzanych przez każdy związek indywidualnie) w celu reaktywacji ekspresji wirusa HIV w komórkach zakażonych latentnie.
2. Może być potrzebny dokładny harmonogram podawania LRA, co sugeruje, że leczenie sekwencyjne mogłoby poprawić efekt podawania dwóch LRA ukierunkowanych na różne mechanizmy latencji.
3. Opóźnienie HIV-1 jest zjawiskiem heterogenicznym. Rzeczywiście, badacze zaobserwowali wcześniej w naszych badaniach reaktywacji przeprowadzonych ex vivo dużą różnorodność kultur komórkowych pacjentów pod względem wzorców odpowiedzi na różne testowane LRA. Odkrycia te sugerują, że represja transkrypcji HIV-1 wynika z heterogenicznych kombinacji mechanizmów molekularnych, które różnią się w zależności od pacjenta. Niejednorodność zaobserwowana przez badaczy pomiędzy pacjentami podkreśla potrzebę oceny skuteczności LRA najpierw ex vivo w hodowlach komórkowych danego pacjenta przed podaniem tego LRA temu danemu pacjentowi in vivo w kontekście badania klinicznego. Niestety, w zdecydowanej większości dotychczasowych badań klinicznych mających na celu reaktywację wirusa HIV-1 z latencji, nie przeprowadzono wstępnej selekcji na podstawie testów reaktywacji ex vivo.
4. Indukcja ekspresji genów utajonych prowirusów HIV ma charakter stochastyczny. Rzeczywiście, grupa Siliciano wykazała, że ​​po jednej rundzie maksymalnej aktywacji komórek T in vitro, niektóre prowirusy pozostają ciche, ale są potencjalnie indukowalne po dodatkowych rundach aktywacji. Aby zmaksymalizować aktywność danej władz lokalnych i regionalnych, należy ją zatem podawać wielokrotnie w wielu punktach czasowych.

W związku z tym optymalizacja części „szoku”, pierwszej części strategii „wstrząsu i zabicia”, obejmowałaby zindywidualizowane i łączone leczenie władz lokalnych i regionalnych, stosowane według dokładnego harmonogramu i powtarzane w wielu punktach czasowych. Aby przygotować tego typu badanie kliniczne, badacze zbadali in vitro i ex vivo kilka typów kombinacji LRA. Jeden z nich miał kilka zalet i został zatwierdzony w terapii ludzi.

Rzeczywiście, epigenetycznie wiadomo, że metylacja DNA i deacetylacja histonów współdziałają w celu ustanowienia i utrzymania środowiska heterochromatyny. Rzeczywiście, białka domeny wiązania metylu (MBD) związane z metylowanym DNA w regionach regulatorów cis mogą służyć jako pomosty między DNA a czynnikami modyfikującymi chromatynę (takimi jak HDAC). W przypadku wirusa HIV wykazano wcześniej, że promotor HIV-1 jest hipermetylowany ex vivo i odporny na reaktywację w utajonych rezerwuarach osób zakażonych wirusem HIV-1, w przeciwieństwie do hipometylowanego 5'LTR zintegrowanych prowirusów obecnych w wiremii pacjenci. Co ciekawe, Trejbalova i in. niedawno donieśli, że metylacja DNA promotora HIV-1 wzrasta stopniowo podczas leczenia cART. Rzeczywiście, autorzy ci wykryli niski poziom metylacji DNA 5' LTR w spoczynkowych limfocytach T CD4+ pacjentów leczonych cART przez okres do 3 lat. Jednakże po długotrwałym stosowaniu cART zaobserwowali akumulację metylacji DNA 5' LTR w utajonym zbiorniku. Stan metylacji DNA promotora HIV-1 może przyczynić się do „zablokowania” cichego stanu prowirusa we współpracy z represyjnymi histonami modyfikacjami potranslacyjnymi, takimi jak deacetylacja histonów, utrudniając w ten sposób powrót prowirusa do stanu aktywnego. Z tego punktu widzenia środki demetylujące mogą stanowić obiecujące leki kandydujące w połączeniu z HDACis do zmniejszania puli rezerwuarów utajonego wirusa HIV pacjentów poddawanych cART przez co najmniej 3 lata.

Co więcej, wiadomo, że dwie modyfikacje epigenetyczne, metylacja DNA i deacetylacja histonów, są ze sobą dynamicznie powiązane i powodują wyciszenie genów w nowotworach. Rzeczywiście, kilka badań przedklinicznych potwierdza pogląd, że farmakologiczne ukierunkowanie zarówno na DNMT, jak i HDAC może skutkować synergistycznym działaniem przeciwnowotworowym. Ponadto trwają dwa badania kliniczne z inhibitorem metylacji DNA Decitabiną i romidepsyną HDACi w terapii nowotworów (NCT00037817, NCT00114257). Inhibitor metylacji DNA, decytabina, zatwierdzony do stosowania w terapii ludzi i HDACis, mają kilka zalet w przypadku strategii usuwania wirusa HIV-1. Zaletą decytabiny jest przenikanie przez barierę krew-mózg, doskonała dystrybucja w płynach ustrojowych i brak indukowania globalnej aktywacji limfocytów T. HDAC nie indukują globalnej proliferacji ani aktywacji komórek T, działają w szerokim spektrum typów komórek i silnie tłumią ekspresję i funkcję receptora chemokin CXCR4. HDACis zidentyfikowano także jako nowe środki uwalniające P-TEFb. Jest to niewątpliwie kolejny kluczowy mechanizm, dzięki któremu HDACi reaktywują ekspresję wirusa HIV. Rzeczywiście, w przejściu od proksymalnej pauzy promotora do produktywnego wydłużenia pośredniczą wirusowy transaktywator Tat i P-TEFb, niezbędny czynnik transkrypcyjny wydłużania komórkowego. W komórkach P-TEFb występuje w postaci aktywnej i nieaktywnej. Jego uwolnienie z nieaktywnego kompleksu małych jądrowych rybonukleoprotein 7SK jest dla P-TEFb krytycznym etapem aktywacji wydłużania transkrypcji. Zatem, co ważne, stosowanie tych dwóch leków może wpływać na inne mechanizmy (inne niż acetylacja histonów i metylacja DNA) związane z latencją wirusa HIV.

1.2 Hipoteza badawcza Nasze laboratorium oceniło niedawno potencjał terapeutyczny środków demetylujących w połączeniu z HDACis w reaktywacji wirusa HIV z latencji in vitro i ex vivo. Potencjał LRA do reaktywacji HIV-1 oceniano najpierw in vitro w dwóch liniach utajonych komórek T (poprzez ilościowe oznaczenie transkrypcji, ekspresji i produkcji HIV-1), a następnie ex vivo w PBMC zubożonych w CD8+ i spoczynkowych hodowlach komórek T CD4+ od 58 pacjentów z awiremią HIV-1+ leczonych cART (poprzez ilościowe oznaczenie wytwarzania wirusa HIV-1). Badacze wykazali, że inhibitor metylacji DNA 5-aza-2'deoksycytydyna (decytabina), ale nie 5-azacytydyna, indukuje ekspresję wirusa HIV in vitro. Następnie badacze wykazali in vitro, że stosuje się sekwencyjne leczenie decytabiną + HDAC w klinicznie tolerowanych dawkach, które synergistycznie indukują ekspresję wirusa HIV, podkreślając po raz pierwszy znaczenie schematu leczenia w przypadku terapii skojarzonych LRA. Co ważne, badacze wykazali fizjologiczne znaczenie tej synergii i aspektu sekwencyjnego ex vivo. Co ciekawe, badane sekwencyjne leczenie skojarzone decytabiną i romidepsyną indukowało regenerację wirusa HIV-1 w większym stopniu niż same leki w hodowlach PBMC zubożonych w CD8+. Podsumowując, badacze po raz pierwszy stwierdzili, że oprócz aspektu kombinacyjnego, sekwencyjny aspekt podawania LRA może mieć kluczowe znaczenie dla strategii oczyszczania mających na celu zmniejszenie rozmiaru zbiornika.

Badacze stawiają hipotezę, że takie sekwencyjne, kombinowane podejście do reaktywacji może prowadzić do zmniejszenia wielkości rezerwuaru HIV-1 do poziomu wystarczającego do umożliwienia kontroli zakażenia HIV przez układ odpornościowy gospodarza i, miejmy nadzieję, przerw w leczeniu. Jednakże pierwszym krokiem w celu podkreślenia korzyści płynących z tego rodzaju interwencji jest ocena wykonalności, bezpieczeństwa i tolerancji takich sekwencyjnych, kombinowanych podejść do reaktywacji.

W związku z tym, w oparciu o nasze wyniki ex vivo i proponowane przez nas optymalizacje części „szoku”, pierwsza część strategii „wstrząsu i zabicia” (obejmująca zindywidualizowane i łączone leczenie władz lokalnych i regionalnych, prowadzona według dokładnego harmonogramu i powtarzalnie o wielu punktów czasowych), badacze proponują rozpoczęcie badania fazy I z udziałem pacjentów zakażonych wirusem HIV-1 podtyp B w ramach cART przez co najmniej 48 miesięcy i wykazującego, zgodnie z najlepszą wiedzą na temat klinicznych wskaźników PI, brak wykrywalnego impulsu wirusa przez co najmniej co najmniej 12 miesięcy w celu oceny wykonalności, bezpieczeństwa i tolerancji leczenia sekwencyjnego decytabiną w skojarzeniu z romidepsyną podawaną w wielu punktach czasowych [jednorazowo (kohorta 1), dwa razy (kohorta 2) lub cztery razy (kohorta 3)] . Celem drugorzędnym będzie także ocena wpływu leczenia skojarzonego (decytabina + romidepsyna) na rezerwuar wirusa i ekspresję genu HIV.