Infuze alogenních lymfocytů efektor vrozeného dárce po transplantaci kmenových buněk: IDEÁLNÍ zkouška (IDEAL)

POPIS PROJEKTU ÚČEL: Zaměřit se na to, zda lze zlepšit výsledky transplantace u pacientů léčených HSCT pro AML/MDS přidáním infuze lymfocytů vrozeného dárce (iDLI) brzy po transplantaci. Primárními výsledky jsou akutní GVHD, relaps a přežití bez relapsu po HSCT.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY Alogenní transplantace hematopoetických kmenových buněk (HSCT) je potenciální léčebná léčba maligních hematologických onemocnění. Hlavní indikací pro HSCT u dospělých je akutní leukémie následovaná myelodysplastickým syndromem. Při HSCT je kostní dřeň a imunitní systém pacienta nahrazen systémem od dárce během rozsáhlého klinického výkonu prováděného ve vysoce specializovaném transplantačním centru. Léčitelným principem HSCT je zabíjení reziduálních leukemických buněk na bázi imunity zprostředkované dárcovskými buňkami nazývané efekt štěpu proti leukémii (GVL).

Základní principy HSCT jsou uvedeny níže:

Kondicionační režim Před infuzí dárcovského štěpu se podává kondicionační režim, aby se snížila nádorová zátěž a oslabil imunitní systém příjemce, aby se umožnilo přihojení dárcovských buněk. Kondicionační režim může obsahovat různé stupně myeloablace v závislosti na požadovaném stupni imunosuprese vhodné pro onemocnění, věk pacienta a komorbiditu.

Dárci a štěpy kmenových buněk Štěp kmenových buněk se nejčastěji získává od sourozence se shodou HLA (25 % pacientů) nebo dárce z nepříbuzného registru se shodou HLA.

Štěp se získává od dárce buď aspirací kostní dřeně nebo leukaferézou (separace buněk a odstranění leukocytů ze zbývající krve) po podání faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), který mobilizuje kmenové buňky do krve. Posledně jmenovaný je známý jako štěp kmenových buněk z periferní krve (PBSC) a je zdaleka nejběžnějším typem štěpu používaným v současné době.

Obsah štěpu a imunitní rekonstituce pacienta Štěp kmenových buněk obsahuje kmenové buňky, které zakládají hematopoézu odvozenou od dárce, včetně funkčního imunitního systému pacienta, ale také zralé imunitní buňky odpovědné za časnou eliminaci reziduálních nádorových buněk prostřednictvím štěpu proti leukémii (GVL) účinek. Imunitní rekonstituce je závislá na dávce a obsahu transplantovaných dárcovských buněk a pro celkový výsledek transplantace je rozhodující jak obsah štěpu, tak imunitní rekonstituce pacienta.

GVL a GVHD Účinek GVL je prováděn lymfocytotoxickými dárcovskými buňkami, které zabíjejí reziduální maligní buňky pacienta. GVL je tradičně zprostředkována dárcovskými ap T buňkami v imunologickém procesu řízeném HLA-rozdíly mezi jednotlivci, tj. alogenní odpovědí.

Při akutním onemocnění štěpu proti hostiteli (GVHD), které také zahrnuje HLA alo-rozpoznání, dárcovské αβ T buňky napadají normální tkáň v kůži, játrech a gastrointestinálním systému příjemce, což vede k potenciálnímu smrtelnému imunitnímu onemocnění. Akutní GVHD se objevuje během prvních 3 měsíců po HSCT a klinický průběh je velmi variabilní, od mírné léčitelné prezentace až po plně rozvinutý imunitní záchvat, který je fatální u 80–90 % pacientů (obr. 2). Akutní GVHD se vyskytuje u 40–60 % pacientů.

Relaps po HSCT Relaps hematologického karcinomu po HSCT je hlavní příčinou mortality. U pacientů s AML/MDS po HSCT dochází u přibližně 30 % k recidivě onemocnění. Prognóza u pacientů s relapsem po HSCT je tristní.

Infuze dárcovských lymfocytů Aby se zabránilo relapsu nebo léčbě zjevného relapsu po HSCT, může být pacientovi podána infuzí dávka dalších buněk od původních dárců kmenových buněk, infuze lymfocytů dárce (DLI), za účelem iniciace obnoveného/posílení efektu GVL a vymýtit zbývající maligní buňky. Účinek konvenční DLI na leukemické buňky, obsahující primárně TCR αβ buňky od dárce, je však nejistý a omezený rizikem letální GVHD, proč jsou nové metody DLI neustále ve vývoji.

Přirozené zabíječské buňky a γδ buňky receptoru T-buněk Během posledních let se ukázalo, že přirozené zabíječské (NK) buňky a γδ buňky receptoru T-buněk (TCR), také nazývané vrozené efektorové buňky, jsou schopné eliminovat rakovinné buňky, a tím přispívat k GVL- účinek v HSCT. NK buňky jsou vrozené lymfocyty, které obsahují přibližně 10 % všech lymfocytů a jejichž účelem je vymýtit „stresované“, maligní a viry infikované buňky. Jsou schopny lyžovat a eliminovat nádorové buňky leukémie prostřednictvím aktivace receptorů rodiny přirozených zabíječů (NK) a přirozených receptorů cytotoxicity (NCR) nezávisle na disparitách HLA.

T buňky typu TCR ap (CD4 a CD8 T buňky) zahrnují většinu všech cirkulujících T buněk a lymfocytů obecně. TCR yδ buňky jsou podskupinou T buněk, které se liší od ap T buněk, které tvoří přibližně 5 % všech T buněk. Repertoár funkcí TCR yδ buněk kombinuje vlastnosti adoptivního imunitního systému s vrozenými reakcemi. Podílejí se na kontrole zánětu, boji s patogeny a udržování tolerance vůči vlastním antigenům. TCR yδ jsou také schopné rozpoznávat nádorové buňky prostřednictvím jejich TCR a aktivovat receptory sdílené s NK buňkami (např. NKG2D) a jejich protinádorové účinky jsou stále častěji dokumentovány proti leukemickým buňkám. Rozpoznávání buněk NK a TCR γδ je nezávislé na disparitách HLA, takže jejich příspěvek ke GVHD je méně pravděpodobný a jejich imunoregulační vlastnosti mohou ve skutečnosti chránit před GVHD. Tyto vrozené efektorové buňky proto mají potenciál zprostředkovat GVL bez GVHD v nastavení HSCT.

Výsledky výzkumné skupiny výzkumníků:

Podle této hypotézy provedla naše skupina v letech 2015–2018 prospektivní klinickou studii zkoumající koncentrace NK a TCR γδ buněk ve štěpech kmenových buněk a během imunitní rekonstituce brzy po transplantaci a spojila je s výsledky pacientů ve smyslu GVHD, relapsu a bez relapsu. přežití. Výsledky ukázaly, že pacienti s transplantovanými vysokými dávkami NK buněk ve štěpu a vysokými koncentracemi NK buněk v periferní krvi časně po transplantaci (28. a 56. den) významně zlepšili přežití bez relapsu ve srovnání s pacienty s nízkými dávkami po transplantaci a časně po transplantaci. transplantované koncentrace NK buněk. Pokud jde o buňky TCR γδ, pacienti s vysokou koncentrací γδ buněk TCR v periferní krvi časně (28. a 56. den) po transplantaci mají významně nižší GVHD a méně relapsů, což vede ke zlepšení celkového přežití a přežití bez relapsu ve srovnání s pacienty s nízkou úrovní po transplantaci TCR yδ buněčné koncentrace.

Na základě těchto výsledků a existující literatury je cílem této studie infuze vrozené DLI (iDLI) obsahující purifikované NK a TCR γδ buňky od původního dárce kmenových buněk časně po HSCT. Očekávaným účinkem další buněčné terapie s těmito vrozenými efektorovými buňkami během časné imunitní rekonstituce je snížená recidiva i četnost GVHD, a tím zlepšené výsledky po HSCT u pacientů s AML/MDS.

Postup Jedná se o společný projekt mezi Transplantační jednotkou kostní dřeně na Klinice hematologie a Oddělením klinické imunologie Rigshospitalet, Kodaňská univerzitní nemocnice.

Přibližně 60 pacientů ročně dostane v našem centru PBSC-HSCT pro diagnózy AML nebo MDS. Jeden ze čtyř pacientů má HLA-identického sourozence, zatímco zbývající pacienti dostávají štěpy kmenových buněk od shodných nepříbuzných dárců z mezinárodních registrů dárců. Pro tuto studii bude aplikována genetická randomizace tak, že pacienti s HLA-identickými sourozenci budou zahrnuti do intervence, zatímco pacienti s nepříbuznými dárci, kteří dostávají standardní HSCT, budou zahrnuti do kontrolní skupiny. Základem návrhu je dostupnost dárce; k darování iDLI lze získat pouze sourozenecké dárce. S odhadovanou mírou náboru přibližně 85 % se očekává, že v intervenční skupině bude zapsáno 13–15 párů pacient/dárce ročně po dobu celkem tří let, což představuje celkem 39–45 párů. V předchozí prospektivní studii vyšetřovatelé získali míru náboru 97 %. Historicky byla vyšší incidence GVHD pozorována u transplantací s použitím nepříbuzného dárce, ale díky přesnější HLA typizaci a lepším protokolům pro imunosupresi je v současnosti GVHD a incidence relapsů srovnatelná mezi příbuznými a nepříbuznými transplantacemi. To je také případ transplantačního centra v Rigshospitalet, jak bylo dříve publikováno6.

Pro zásah:

Dárci projdou zdravotním screeningem v Buněčné terapii, oddělení klinické imunologie do 30 dnů před odběrem (standardní postup). 7. den před HSCT: Zahájení přípravného režimu připravujícího pacienta na HSCT (standardní postup) 5. den před HSCT: Zahájení G-CSF stimulace dárce za účelem mobilizace kmenových buněk pro leukaferézu (standardní postup).

Dárcovská leukaferéza a infuze štěpu pacientům, označované jako den 0 HSCT (standardní postup) 14. den po HSCT: leukaferéza dárce (bez předchozí stimulace G-CSF), manipulace s produktem a transfuze iDLI pacientovi (intervence).

Kontrolní skupina: Standardní HSCT postup, jak je popsáno výše, u pacientů, kteří dostávají štěpy od nepříbuzných dárců.

Postup upraveného DLI = iDLI:

Bílé krvinky se získávají od dárce leukaferézou za použití Spectra Optia Apheresis. System (Terumo BCT) na oddělení krevní banky, oddělení klinické imunologie, Rigshospitalet. Purifikace vrozených efektorových buněk se provádí deplecí TCRαβ/CD19 z čerstvého produktu leukaferézy pomocí systému CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). Tento postup odstraňuje TCRαβ T buňky spolu s B lymfocyty (CD19 pozitivní buňky), čímž se získá buněčný produkt obohacený o NK buňky a TCR γδ buňky a je rutinně používán v Rigshospitalet pro procedury zapojené do dětských transplantací.

Zamýšlená dávka odebraných buněk je 108 lymfocytů/kg, což vede k očekávaným buněčným dávkám 107 NK buněk/kg a 1-5 x 106 TCR y5 buněk/kg po vyčerpání. Produkt iDLI je pacientovi čerstvě podán na Klinice hematologie krátce po proceduře vyčerpání.

Imunitní fenotypizace:

Imunitní fenotypizace produktu iDLI i originálního štěpu kmenových buněk bude provedena pomocí vysoce standardizovaného zákaznicky navrženého lyofilizovaného panelu průtokové cytometrie (produkt DuraClone od Beckman Coulter) vyvinutého a rutinně používaného pro monitorování imunitních funkcí na Oddělení klinické imunologie. V této studii budou zahrnuty dvě zkumavky pro detailní fenotypizaci lymfocytů.

Zkumavka 1 obsahuje markery celkových T buněk (CD3, CD4, CD8), podtypů NK buněk (CD16, CD56), B buněk (CD19) a monocytů (CD14). Zkumavka 2 obsahuje markery celkových TCR α/β buněk, celkových TCR γ/δ buněk, dva hlavní TCR γ/δ podtypy (TCR Vδ1, TCR Vδ2) a TCR γ/δ aktivační markery buněk (HLA-DR, CD8, CD8beta ).

Stejný panel bude použit pro charakterizaci imunitní rekonstituce ve vzorcích periferní krve u pacientů v den infuze iDLI a 14 a 21 dní poté (tj. den 14, 28 a 56 po transplantaci. Životaschopné buňky budou kryokonzervovány pro pozdější funkční studie.

Plán správy dat Klinická data o výsledcích pacientů a transplantací budou získávána z databáze klinických transplantací (IBMTR 2019) umístěné a spravované na transplantační jednotce, Hematologické oddělení. Data průtokové cytometrie z charakterizace produktů iDLI, štěpů kmenových buněk a imunitní rekonstituce pacienta budou získána z oddělení klinické imunologie a zpracována vhodným analytickým softwarem (Kaluza, Flow Cytometry Analysis Software, Beckman Coulter). Klinická a laboratorní data budou sestavena, strukturována a zpracována v SPSS (SPSS® Statistics, IBM), který bude společně s R (The R Project for Statistical Computing, www.r-project.org) použit pro statistické analýzy. Všechna data budou uložena v Rigshospitalet, Kodaňská univerzitní nemocnice v souladu s pravidly ochrany dat Dánské agentury pro ochranu dat.

Statistické analýzy Kumulativní incidence akutní GVHD a relapsu u pacientů léčených iDLI ve srovnání s pacienty, kteří dostávali standardní HSCT, bude porovnána pomocí Grayovy konkurenční analýzy rizik. Přežití bez relapsu mezi oběma skupinami bude porovnáno pomocí Kaplan Meierovy analýzy přežití a Coxových modelů proporcionálního rizika. Buněčné dávky a imunitní fenotypizace štěpů iDLI a původních kmenových buněk a koncentrace buněk a fenotypizace během imunitní rekonstituce pacienta budou zadány pomocí deskriptivní statistiky. Pro statistické výpočty budou použity SPSS (SPSS® Statistics, IBM) a R (The R Project for Statistical Computing, www.r-project.org).

Výkon Na základě výsledků předchozí studie výzkumné skupiny výzkumníků popisující GVHD, relaps a přežití bez relapsu u pacientů s vysokými versus nízkými dávkami NK/TCR γδ buněk v transplantovaných štěpech a během časné imunitní rekonstituce. Vyšetřovatelé předpokládají snížení výskytu relapsu z 30 % na 5 % a snížení akutního výskytu GVHD z 50 % na 20 %. S genetickou randomizací budou do intervence zařazeni pacienti s HLA identickými sourozenci, zatímco pacienti s nepříbuznými dárci, kteří dostávají standardní HSCT, budou zahrnuti jako kontroly. Testováno na hladině významnosti 0,05 s mocninou 80 % (beta 0,2), velikost vzorku 35–38 pacientů v každé skupině je vhodná pro studii.