Инфузия врожденных донорских эффекторных аллогенных лимфоцитов после трансплантации стволовых клеток: исследование IDEAL (IDEAL)

ОПИСАНИЕ ПРОЕКТА ЦЕЛЬ: выяснить, можно ли улучшить результаты трансплантации у пациентов, получавших ТГСК по поводу ОМЛ/МДС, путем добавления инфузии врожденных донорских лимфоцитов (iDLI) в ранние сроки после трансплантации. Первичными исходами являются острая РТПХ, рецидив и безрецидивная выживаемость после ТГСК.

ПРЕДПОСЫЛКИ Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является потенциальным радикальным методом лечения злокачественных гематологических заболеваний. Основным показанием для ТГСК у взрослых является острый лейкоз с последующим миелодиспластическим синдромом. При ТГСК костный мозг и иммунная система пациента заменяются на донорские во время обширной клинической процедуры, проводимой в узкоспециализированном центре трансплантации. Излечимым принципом ТГСК является основанное на иммунитете уничтожение остаточных лейкозных клеток между клетками, опосредованное донорскими клетками, называемое эффектом «трансплантат против лейкемии» (GVL).

Основные принципы ТГСК приведены ниже:

Режим кондиционирования Перед введением донорского трансплантата проводится режим кондиционирования, чтобы уменьшить опухолевую нагрузку и ослабить иммунную систему реципиента, чтобы обеспечить приживление донорских клеток. Режим кондиционирования может включать различные степени миелоабляции в зависимости от желаемой степени иммуносупрессии, соответствующей заболеванию, возрасту пациента и сопутствующей патологии.

Доноры и трансплантаты стволовых клеток Трансплантат стволовых клеток чаще всего получают от HLA-совместимого брата или сестры (25% пациентов) или HLA-совместимого неродственного зарегистрированного донора.

Трансплантат получают от донора либо путем аспирации костного мозга, либо путем лейкафереза ​​(отделение клеток и удаление лейкоцитов из оставшейся крови) после введения гранулоцитарно-колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), мобилизующего стволовые клетки в кровь. Последний известен как трансплантат стволовых клеток периферической крови (PBSC) и на сегодняшний день является наиболее распространенным типом трансплантата, используемым в настоящее время.

Содержимое трансплантата и восстановление иммунитета пациента Трансплантат стволовых клеток содержит стволовые клетки, которые обеспечивают донорское кроветворение, включая функциональную иммунную систему пациента, а также зрелые иммунные клетки, ответственные за раннюю элиминацию остаточных опухолевых клеток посредством реакции «трансплантат против лейкемии» (GVL). эффект. Восстановление иммунитета зависит от дозы и содержания трансплантированных донорских клеток, и как содержимое трансплантата, так и восстановление иммунитета пациента имеют решающее значение для общего результата трансплантации.

ГВЛ и РТПХ Эффект ГВЛ осуществляется лимфоцитотоксическими донорскими клетками, убивающими остаточные злокачественные клетки больного. GVL традиционно опосредуется донорскими αβ Т-клетками в иммунологическом процессе, обусловленном HLA-различиями между людьми, то есть аллогенной реакцией.

При острой реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ), также включающей алло-распознавание HLA, донорские αβ Т-клетки атакуют нормальные ткани кожи, печени и желудочно-кишечного тракта реципиента, что приводит к потенциально смертельному иммунному заболеванию. Острая РТПХ возникает в течение первых 3 месяцев после ТГСК, а клиническое течение сильно варьирует от легкого излечимого проявления до полномасштабной иммунной атаки, которая приводит к летальному исходу у 80-90% пациентов (рис. 2). Острая РТПХ наблюдается у 40-60% больных.

Рецидив после ТГСК Рецидив гематологического рака после ТГСК является основной причиной смертности. Примерно у 30% пациентов с ОМЛ/МДС после ТГСК возникает рецидив заболевания. Прогноз у пациентов с рецидивом после ТГСК неблагоприятный.

Инфузия донорских лимфоцитов Для предотвращения рецидива или лечения манифестного рецидива после ТГСК пациенту может быть введена доза дополнительных клеток от исходных доноров стволовых клеток, инфузия донорских лимфоцитов (DLI) с целью инициации возобновления/усиления эффекта GVL. и уничтожить оставшиеся злокачественные клетки. Однако влияние на лейкемические клетки обычных DLI, содержащих преимущественно TCR αβ клетки донора, является неопределенным и ограничено риском летальной РТПХ, поэтому постоянно разрабатываются новые методы DLI.

Естественные клетки-киллеры и γδ-клетки с Т-клеточным рецептором. В последние годы естественные киллеры (NK) и γδ-клетки с Т-клеточным рецептором (TCR), также называемые врожденными эффекторными клетками, доказали свою способность устранять раковые клетки и тем самым вносить свой вклад в GVL- эффект при ТГСК. NK-клетки представляют собой врожденные лимфоциты, составляющие примерно 10% всех лимфоцитов и предназначенные для эрадикации «стрессовых», злокачественных и инфицированных вирусом клеток. Они способны лизировать и элиминировать опухолевые клетки лейкемии посредством активации рецепторов семейства естественных киллеров (NK) и рецепторов естественной цитотоксичности (NCR) независимо от различий HLA.

Т-клетки типа TCR αβ (CD4 и CD8 Т-клетки) составляют большинство всех циркулирующих Т-клеток и лимфоцитов в целом. γδ-клетки TCR представляют собой подгруппу Т-клеток, отличную от αβ-Т-клеток, которые составляют примерно 5% всех Т-клеток. Репертуар функций клеток TCR γδ сочетает в себе черты адоптивной иммунной системы с врожденными реакциями. Они участвуют в контроле воспаления, борьбе с патогенами и поддержании толерантности к собственным антигенам. TCR γδ также способны распознавать опухолевые клетки посредством их TCR и активировать рецепторы, общие с NK-клетками (например, NKG2D) и их противоопухолевые эффекты в отношении лейкемических клеток все чаще документируются. Распознавание клеток NK и TCR γδ не зависит от различий HLA, что делает их вклад в РТПХ менее вероятным, а их иммунорегуляторные свойства могут фактически защищать от РТПХ. Таким образом, эти врожденные эффекторные клетки могут опосредовать GVL без GVHD в условиях HSCT.

Результаты исследовательской группы исследователей:

В соответствии с этой гипотезой наша группа провела проспективное клиническое исследование в течение 2015–2018 гг., изучая концентрации NK- и TCR-γδ-клеток в трансплантатах стволовых клеток и во время восстановления иммунитета в ранние сроки после трансплантации и связывая их с исходами пациентов с точки зрения РТПХ, рецидивов и безрецидивных состояний. выживание. Результаты показали, что у пациентов, которым трансплантировали высокие дозы NK-клеток в трансплантате и высокие концентрации NK-клеток в периферической крови в ранние сроки после трансплантации (на 28-й и 56-й день), значительно улучшилась безрецидивная выживаемость по сравнению с пациентами с низкими дозами трансплантата и в ранние сроки после трансплантации. концентрации трансплантированных NK-клеток. Что касается клеток TCR γδ, у пациентов с высокой концентрацией клеток TCR γδ в периферической крови в ранние сроки (28 и 56 день) после трансплантации наблюдается значительно меньшая РТПХ и меньше рецидивов, что приводит к улучшению общей выживаемости и безрецидивной выживаемости по сравнению с пациентами с низкой посттрансплантационной выживаемостью. Концентрации клеток TCR γδ.

Основываясь на этих результатах и ​​существующей литературе, целью этого исследования является введение врожденного DLI (iDLI), содержащего очищенные NK и TCR γδ клетки от исходного донора стволовых клеток в ранние сроки после ТГСК. Ожидаемым эффектом дополнительной клеточной терапии с этими врожденными эффекторными клетками во время раннего восстановления иммунитета является снижение частоты рецидивов, а также частоты РТПХ и, таким образом, улучшение результатов после ТГСК у пациентов с ОМЛ/МДС.

Процедура Это совместный проект между отделением трансплантации костного мозга отделения гематологии и отделением клинической иммунологии Rigshospitalet Университетской больницы Копенгагена.

Приблизительно 60 пациентов в год получают PBSC-HSCT для диагностики ОМЛ или МДС в нашем центре. Каждый четвертый пациент имеет HLA-идентичного брата или сестру, в то время как остальные пациенты получают трансплантаты стволовых клеток от неродственных доноров из международных реестров доноров. Для этого исследования будет применена генетическая рандомизация, так что пациенты с HLA-идентичными братьями и сестрами будут включены для вмешательства, в то время как пациенты от неродственных доноров, получающих стандартную ТГСК, будут включены в контрольную группу. Основанием для разработки является доступность доноров; только родные доноры могут быть привлечены для пожертвования iDLI. При расчетном коэффициенте набора примерно 85%, ожидается, что 13-15 пар пациент/донор в группе вмешательства будут зачисляться в год в течение трех лет, что дает в общей сложности 39-45 пар. В предыдущем проспективном исследовании исследователи получили уровень набора 97%. Исторически более высокая частота РТПХ наблюдалась при трансплантации от неродственного донора, но благодаря более точному HLA-типированию и более совершенным протоколам иммуносупрессии частота РТПХ и рецидивов в настоящее время сопоставима между родственными и неродственными трансплантатами. То же самое относится и к центру трансплантации в Ригшоспиталете, как было опубликовано ранее6.

Для вмешательства:

Доноры проходят медицинский осмотр в отделении клеточной терапии отделения клинической иммунологии в течение 30 дней до сдачи крови (стандартная процедура). День 7 перед ТГСК: Начало режима кондиционирования, подготовка пациента к ТГСК (стандартная процедура). День 5 перед ТГСК: Начало стимуляции Г-КСФ донора с целью мобилизации стволовых клеток для лейкафереза ​​(стандартная процедура).

Донорский лейкаферез и инфузия трансплантата пациентам, обозначенный как день 0 ТГСК (стандартная процедура). День 14 после ТГСК: донорский лейкаферез (без предшествующей стимуляции Г-КСФ), манипуляции с продуктом и переливание иДЛИ пациенту (вмешательство).

Контрольная группа: Стандартная процедура ТГСК, как описано выше, у пациентов, получающих трансплантаты от неродственных доноров.

Процедура модифицированного DLI = iDLI:

Лейкоциты получают от донора путем лейкафереза ​​с использованием Spectra Optia Apheresis. Система (Terumo BCT) в отделении банка крови, отделение клинической иммунологии, Ригшоспиталет. Очистку врожденных эффекторных клеток проводят путем истощения TCRαβ/CD19 свежего продукта лейкафереза ​​с помощью системы CliniMACS Prodigy System (Miltenyi Biotec). Эта процедура удаляет T-клетки TCRαβ вместе с B-клетками (CD19-позитивными клетками), образуя клеточный продукт, обогащенный NK-клетками и TCR γδ-клетками, и обычно используется в Rigshospitalet для процедур, связанных с педиатрической трансплантацией.

Предполагаемая доза собранных клеток составляет 108 лимфоцитов/кг, что дает ожидаемые дозы клеток 107 NK-клеток/кг и 1-5×106 клеток TCR γδ/кг после истощения. Новый продукт iDLI вводится пациенту в отделении гематологии вскоре после процедуры истощения.

Иммунный фенотип:

Иммунное фенотипирование продукта iDLI, а также исходного трансплантата стволовых клеток будет выполняться с использованием высокостандартизированной панели лиофилизированной проточной цитометрии, разработанной заказчиком (продукт DuraClone от Beckman Coulter), которая регулярно используется для мониторинга иммунной функции в отделении клинической иммунологии. В это исследование будут включены две пробирки для детального фенотипирования лимфоцитов.

Пробирка 1 включает маркеры общих Т-клеток (CD3, CD4, CD8), подтипов NK-клеток (CD16, CD56), В-клеток (CD19) и моноцитов (CD14). Пробирка 2 содержит маркеры всех клеток TCR α/β, всех клеток TCR γ/δ, двух основных подтипов TCR γ/δ (TCR Vδ1, TCR Vδ2) и маркеры активации клеток TCR γ/δ (HLA-DR, CD8, CD8beta). ).

Та же панель будет использоваться для характеристики восстановления иммунитета в образцах периферической крови у пациентов в день инфузии iDLI и через 14 и 21 день после этого (т. 14, 28 и 56 сутки после трансплантации. Жизнеспособные клетки будут криоконсервированы для последующих функциональных исследований.

План управления данными Клинические данные о пациентах и ​​результатах трансплантации будут получены из клинической базы данных трансплантаций (IBMTR 2019), расположенной и управляемой в отделении трансплантации отделения гематологии. Данные проточной цитометрии, полученные при характеристике продуктов iDLI, трансплантатов стволовых клеток и восстановлении иммунитета пациента, будут получены в отделении клинической иммунологии и обработаны соответствующим программным обеспечением для анализа (Kaluza, программное обеспечение для анализа проточной цитометрии, Beckman Coulter). Клинические и лабораторные данные будут собраны, структурированы и обработаны в SPSS (SPSS® Statistics, IBM), которая вместе с R (Проект R для статистических вычислений, www.r-project.org) будет использоваться для статистического анализа. Все данные будут храниться в Университетской больнице Копенгагена Rigshospitalet в соответствии с правилами защиты данных Датского агентства по защите данных.

Статистический анализ Совокупная частота острой РТПХ и рецидивов у пациентов, получавших иДЛИ, по сравнению с пациентами, получающими стандартную ТГСК, будет сравниваться с использованием анализа конкурирующих рисков Грея. Безрецидивная выживаемость между двумя группами будет сравниваться с использованием анализа выживаемости Каплана Мейера и моделей пропорционального риска Кокса. Дозы клеток и иммунный фенотип iDLI и исходных трансплантатов стволовых клеток, а также концентрации клеток и фенотипирование во время восстановления иммунитета пациента будут введены с использованием описательной статистики. SPSS (SPSS® Statistics, IBM) и R (Проект R для статистических вычислений, www.r-project.org) будут применяться для статистических вычислений.

Мощность Основано на результатах предыдущего исследования исследовательской группы исследователей, описывающих РТПХ, рецидивы и безрецидивную выживаемость у пациентов с высокими и низкими дозами NK/TCR γδ-клеток в трансплантатах и ​​во время раннего восстановления иммунитета. Исследователи ожидают снижения частоты рецидивов с 30% до 5% и снижения заболеваемости острой РТПХ с 50% до 20%. При генетической рандомизации пациенты с HLA-идентичными братьями и сестрами будут включены для вмешательства, в то время как пациенты от неродственных доноров, получающих стандартную ТГСК, будут включены в качестве контрольной группы. Протестировано на уровне значимости 0,05 с мощностью 80% (бета 0,2), размер выборки 35-38 пациентов в каждой группе подходит для исследования.