Inovativní terapeutická léčba k inhibici perineurální invaze u adenokarcinomu pankreatu (PNIPDAC)

NÁVRH STUDIE Hlavním cílem tohoto projektu je vyvinout nové terapeutické přístupy k omezení tvorby PNI a tím i tvorby a metastáz PDAC. PNI, má svůj vyšší výskyt u PDAC, kde je uznávaným rizikovým faktorem špatného přežití. Vzhledem ke klinickému významu PNI a jeho roli v PDAC je naléhavé identifikovat molekulární PNI signatury pro vývoj nových terapeutických strategií. Nedávno jsme identifikovali molekulu (FGFBP1), která se aktivuje v buňkách rakoviny pankreatu a iniciuje PNI.

Tento projekt je navržen jako observační multicentrická, průřezová studie. OSR je jediným centrem, které přijímá pacienty. OSR odešle organoidy získané z biologických vzorků zapsaných pacientů do zúčastněného centra UO 3 (ASL3 Lecce), které provede proteomické analýzy ke stanovení úrovně exprese inhibitoru FGFBP1 naloženého v hydrogelech nanočástic. Vytvoříme a ověříme účinnost hydrogelu s obsahem NP nesoucího inhibitory FGFBP1 a vyvinutého CNR Nanotec Lecce (Cíl 1, UO 2), jehož biochemické uvolňování bude testováno hmotnostní spektrometrií pomocí UO 3 ASL3 Lecce; ověříme jejich biologickou účinnost na myelinizovaných Schwannových buňkách neuronových kokulturách nasazených lidskými organoidy nesoucími hydrogely s NP (Cíl 2 - OSR) a in vivo na myších TPAC, nedávno vyvinutém zvířecím modelu PDAC, jehož slinivka bude injikována NP -naplněné hydrogely (Cíl 3 - OSR).

Délka studie Délka zápisu: 18 měsíců Délka celkového sledování: u zařazených pacientů není potřeba žádné sledování Délka celkového období studie: 24 měsíců

POPULACE STUDIE Účastníci studie Dospělí pacienti podstupující chirurgickou resekci pankreatu podle klinické praxe s klinicky a radiologicky potvrzenou diagnózou duktálního adenokarcinomu. Všichni pacienti budou zařazeni na OSR jednotku pankreatické a transplantační chirurgie.

Kritéria zahrnutí

• Věk >18 let (může být zahrnut i fertilní pacient)
• Chirurgická resekce pro podezření na PDAC podle klinické praxe. Tento materiál použijeme jak pro kontroly, tak pro vzorky kufříků.

Kritéria vyloučení

• Pacienti ve věku < 18 let
• Pacienti, kteří nejsou schopni podepsat informovaný souhlas
• Pacienti s podezřením na PDAC nepotvrzeným při patologickém hlášení Selhání screeningu Účastníci, kteří souhlasili s účastí v klinické studii a kteří nesplňují jedno nebo více kritérií požadovaných pro účast ve studii během screeningových postupů, jsou považováni za neúspěšné screeningu.

STUDIJNÍ OBJEKT Popis studijního objektu

Toto je observační studie, která nevyžaduje další experimentální postupy pro zařazené pacienty.

Všichni pacienti budou léčeni podle pokynů bez ohledu na jejich rozhodnutí zúčastnit se studie. Všichni pacienti, kteří se zúčastní, podepíší formulář informovaného souhlasu připojený k tomuto protokolu.

V cíli 1 (nevyžaduje se žádný lidský materiál) bude UO 2 (CNR-Nanotech Lecce) vyvíjet a charakterizovat hydrogely naplněné NP schopné uvolňovat inhibitory FGFBP1. Hydrogely budou charakterizovány reometrií, mechanickým testováním, morfologickou analýzou, testem permeability/difúze, bobtnáním a testy stability/degradace za fyziologických podmínek. Buněčné studie (životaschopnost, morfologie, motilita, proliferace) umožní vyhodnotit interakci mezi hydrogely a myšími pankreatickými buňkami pro výběr nejvýkonnějších kompozic.

Získané nanočástice budou charakterizovány: pomocí techniky rozptylu světla bude sledován jejich povrchový náboj, hydrodynamický průměr, distribuce částic a jejich stabilita v biologických pufrech. Morfologie nanočástic bude studována pomocí rastrovací i transmisní elektronové mikroskopie. Profily zatížení a uvolňování inhibitorů FGFBP1 při různých stimulech budou monitorovány pokročilými analytickými technikami (chromatografické separace a detekce hmotnostní spektroskopií). Biokompatibilita nejlepších nanoformulací bude hodnocena provedením testů životaschopnosti, testů prozánětlivých aktivit, monitorování buněčného cyklu, testu hemolýzy. Tato vyšetření budou prováděna díky dostupnosti přístrojového vybavení jako je průtokový cytometr, multimódová čtečka destiček a laserová skenovací konfokální mikroskopie ve spojení s buněčnou kulturou. Účinné uvolňování inhibitoru FGFBP1 bude testováno pomocí hmotnostních spektrometrických analýz pomocí UO 3 ASL3 Lecce pomocí hmotnostních spektroskopických testů.

V cíli 2 bude UO 1 (OSR) generovat lidské a myší organoidy z pacientů zařazených k chirurgickému výkonu po potvrzené diagnóze PDAC a z myší TPAC, v daném pořadí.

Organoidy rekapitulují epiteliální architekturu svého původního orgánu a reprodukují environmentální signály přítomné v normální tkáni i rakovině, přičemž si zachovávají původní genetické mutace (Lau et al, 2020).

Z pacientů s PDAC, jejichž diagnóza byla potvrzena klinicky a radiologicky, připravíme lidské pankreatické organoidy. Pacienti budou informováni a požádáni o podpis souhlasu s odběrem tkáně. Resekované vzorky odebrané ve sterilních podmínkách budou předány patologovi k předběžné histologické charakterizaci. Po izolaci nádoru nám patolog poskytne jeho malou část, kterou uchováme v 50ml sterilní zkumavce za přítomnosti bazálního média při 4°C po dobu 16 hodin k odstranění tuku a krvinek. Dále oddělíme buňky od okolní vláknité tkáně mechanickou disekcí následovanou enzymatickým štěpením 0,125 mg/ml kolagenázy, 0,125 mg/ml dispázy a 0,125 mg/ml DNAázy. Abychom odstranili nestrávený materiál, propasírujeme jej přes 40 μm buněčné síto. Veškerý odebraný materiál bude poté odstředěn, resuspendován ve studeném Matrigelu a nanesen na předehřáté 4jamkové kultivační destičky.

Připravíme také myší organoidy z pankreatu myší TPAC, nedávno vyvinutý zvířecí model, který vyvíjí PDAC a PNI od 12 měsíců věku a věrně reprodukuje rysy lidské rakoviny.

Tkáň odebraná od člověka i myši bude nejprve mechanicky disociována a poté enzymaticky štěpena, aby se získaly jednotlivé buňky. Jako kontrolu buď připravíme naivní organoidy a organoidy zalité hydrogely bez inhibitoru FGFBP1. Všechny buňky budou resuspendovány ve studeném Matrigelu a umístěny na předehřáté 4jamkové kultivační destičky.

Zavedeme také organoidy z myšího pankreatu zvířecího modelu TPAC charakterizovaného rozsáhlým PNI u PDAC a ze zdravých myších pankreatu jako kontrolu.

Abychom ověřili účinnost hydrogelu na bázi NP, vyvinutého UO 1 CNR Nanotec Lecce, při blokování exprese FGFBP1 a omezení tvorby PNI v PDAC, nejprve provedeme proteomické analýzy (UO 3 ASL3 Lecce), abychom monitorovali účinné uvolňování inhibitoru .

Budeme také určovat účinnou inhibici signalizace FGFBP1 v organoidech naplněných hydrogely inhibitoru FGFBP1 a relativní kontroly pomocí qRT-PCR (mRNA) a analýz Western blotting (protein) při pohledu na specifické downstream signalizační efektory. Dále budeme sledovat vliv hydrogelů uvolňujících inhibitor FGFBP1 na růst a tvorbu organoidů pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu a imunofluorescenční analýzy na CK19, marker exokrinních duktálních buněk a Sox 9, marker duktální linie pankreatických novotvarů. Dále založíme neuronové kokultury Schwannových buněk z neuronů dorzálních kořenových ganglií myší E13.5 jako v (Taveggia a Bolino 2018), vložíme je do Matrigelu, aby byly zachovány srovnatelné kultivační podmínky s organoidy, a necháme kultury myelinovat 21 dní v přítomnost 50 ug/ml kyseliny askorbové. Naše předběžná data ukazují, že organoidy PDAC nasazené na myelinizované kokultury vyvolávají rychlou a rozsáhlou degeneraci myelinu, jak bylo hodnoceno barvením MBP. Navíc je tato událost rychle blokována, pokud organoidy PDAC neexprimují FGFBP1. Nasadíme tedy lidské a myší organoidy obsahující hydrogely NP inhibitoru FGFBP1 a relativní kontroly na neuronové kokultury myelinizovaných Schwannových buněk. Kultury budeme udržovat po dobu dalších 3, 7, 10, 15 a 21 dnů a budeme monitorovat rozsah myelinizace a axonální integrity pomocí imunofluorescenční analýzy MBP a NF.

Protože v našich předběžných datech blokování signalizace FGFBP1 zachraňuje myelinizaci, očekáváme, že neuronální myelinizované kokultury v kontaktu s organoidy naplněnými NP hydrogely uvolňujícími inhibitor FGFBP1 nebudou degenerovat na rozdíl od kontrol. Zvláště zajímavé bude srovnání možných rozdílů mezi organoidy pocházejícími z člověka a myši.

V cíli 3 (nevyžaduje se žádný lidský materiál) se UO 1 vstříkne do slinivky břišní myší TPAC, což je nedávno vyvinutý zvířecí model pro PDAC, hydrogely s NP uvolňující inhibitor FGFB1.

Nejprve vyhodnotíme hladinu exprese FGFBP1 na úrovni mRNA a proteinu. a exprese CK19 a Sox 9 (rakovinové buňky), NF 200 (axony) a GFAP (SC). Všechny analýzy se provedou na 5 myších/skupinu, aby se dosáhlo statistické významnosti. Paralelně budeme také hodnotit hladiny exprese těchto proteinů analýzou Western blotting podle standardních protokolů. Abychom potvrdili účinnost NP-naplněných hydrogelů nesoucích inhibitor FGFBP1, vložíme je přímo do ocasu parenchymu pankreatu myší TPAC chirurgickými postupy. Paralelně budeme vstřikovat hydrogely neobsahující nanočástice do pankreatu myší TPAC, které budou sloužit jako negativní kontroly. Tvorba nádoru budeme monitorovat ultrazvukovými analýzami 10-, 20-, 30- 40- a 50 dní po injekci hydrogelu. Myši pozitivní na tvorbu nádoru budou podrobeny analýze MRI v OSR Preclinic Imaging Facility, aby se určila přítomnost metastázy v blízkých orgánech (játra / peritoneum). Na konci každého časového bodu budou myši usmrceny, perfundovány ve 4% PFA a celá břišní dutina zahrnuta do OCT pro analýzu histologických charakteristik primárního nádoru a posouzení přítomnosti PNI v zadních nervových kmenech a gangliích. V kryostatu budou nařezány příčné řezy o tloušťce 12 μm, shromážděny na sklíčka Superfrost plus a zpracovány pro barvení hematoxylinem a eosinem a imunofluorescenci pro CK 19, Sox 9 (rakovinové buňky) a NF200 (axony). Slezina, dvanáctník, žaludek, játra, ledviny, plíce, pobřišnice a bránice budou také odebrány do 10% pufrovaného formalínu, zalitého do parafínového vosku a 3 μm řezy obarvené hematoxylinem a eosinem, aby se detekovala tvorba metastáz.

STUDIJNÍ POSTUPY Všechny studijní návštěvy budou prováděny podle aktuální klinické praxe. Nebudou prováděny žádné další postupy.

Informovaný souhlas Informovaný souhlas je proces, který je zahájen před tím, než jednotlivec souhlasí s účastí ve studii a pokračuje po celou dobu účasti jednotlivce ve studii. Formuláře souhlasu budou schváleny EK a účastník bude požádán, aby si dokument přečetl a zkontroloval. Zkoušející (v souladu s platnými regulačními požadavky) nebo osoba určená zkoušejícím a na odpovědnost zkoušejícího vysvětlí účastníkovi výzkumnou studii a zodpoví veškeré otázky, které mohou vyvstat. Bude poskytnuto slovní vysvětlení v termínech vhodných k tomu, aby účastník pochopil účely, postupy a potenciální rizika studie a jejich práva jako účastníků výzkumu. Účastníci budou mít možnost před podpisem pečlivě zkontrolovat formulář písemného souhlasu a položit otázky. Účastníci by měli mít možnost diskutovat o studii se svou rodinou nebo náhradníky nebo o ní přemýšlet předtím, než souhlasí s účastí. Účastníci musí být informováni, že účast je dobrovolná a že mohou ze studie kdykoli bez újmy odstoupit. Kopie dokumentu s informovaným souhlasem bude předána účastníkům pro jejich evidenci. Proces informovaného souhlasu bude proveden a zdokumentován ve zdrojovém dokumentu (včetně data) a podepsaném formuláři předtím, než účastník podstoupí jakýkoli postup specifický pro studii / budou shromážděny jakékoli údaje. Práva a blaho účastníků budou chráněny tím, že jim bude zdůrazněno, že kvalita jejich lékařské péče nebude nepříznivě ovlivněna, pokud se odmítnou zúčastnit této studie.

Nábor a screening subjektu Všichni chirurgicky kandidátští pacienti pro PDAC budou považováni za způsobilé pro zařazení do této studie. Optimálním cílem by bylo získat alespoň 50 pacientů ve studijním období (18měsíční zápis) Identifikace subjektu Identifikační kód subjektu bude přidělován postupně (tj.: PNI_XXX; XXX je progresivní číslo subjektu ve vzestupném pořadí počínaje 001).

Bude veden identifikační seznam pacientů. Základní hodnocení Základní postupy se shodují s podepsáním informovaného souhlasu s účastí ve studii. Vzhledem k tomu, že se skutečně jedná o průřezovou studii, nejsou pro zúčastněného pacienta plánovány žádné další postupy ad hoc pro studii.

Definice konce studie Podle návrhu studie je konec studie definován jako poslední pacient, který byl vyhodnocen a my uzavřeme všechny experimenty in vitro a in vivo.

Předčasné ukončení nebo pozastavení studie Tato studie může být dočasně pozastavena nebo předčasně ukončena oprávněným zástupcem sponzora nebo PI na kterémkoli místě, pokud existuje dostatečný rozumný důvod. Strana, která pozastavuje nebo ukončuje studii, poskytne účastníkům studie, zkoušejícímu, financující agentuře a regulačním orgánům písemné oznámení dokumentující důvod pozastavení nebo ukončení studie. Při ukončení studie sponzor a hlavní zkoušející zajistí, aby byla věnována náležitá pozornost ochraně zájmů subjektů.

UKONČENÍ A ODSTOUPENÍ Účastníci mohou na požádání kdykoli odstoupit od účasti ve studii.

MANIPULACE SE VZORKY NP Plněné hydrogely uvolňující inhibitory FGFBP1 vyvine UO 2 CNR Nanotec Lecce.

UO 1 připraví organoidy odvozené od člověka a myši nesoucí NP naplněné hydrogely uvolňující inhibitory FGFBP1. UO 3, ASL3 Lecce, určí účinné uvolňování inhibitorů FGFBP1 v organoidech pomocí proteomických analýz.

Založíme organoidy od chirurgicky resekovaných pacientů s PDAC, u kterých byla diagnóza duktálního adenokarcinomu potvrzena klinicky i radiologicky na OSR pankreatické a transplantační chirurgii. Organoidy budou založeny v laboratoři Axo-Glial Interaction Unit (v rámci OSR). Všechny organoidy lidského a myšího původu budou uloženy v OSR CRB a v laboratoři Axo-Glial Interaction Unit na OSR pro budoucí studie, kromě části a těch, které nesou NP-naplněné hydrogely, které budou odeslány do ASL3, Lecce, pro proteomickou analýzu pro ověření účinného uvolňování inhibitoru FGFBP1. Po analýzách, které budou trvat přibližně 2 týdny, se všechny organoidy zaslané do ASL3 Leccesamples vrátí do OSR a zničí se.

Vyvinuté organoidy nesoucí NP-naplněné hydrogely budou validovány in vitro na myelinizovaných kokulturách neuronů Schwannových buněk pro jejich účinnost při omezování/blokování degenerace myelinu. Naše předběžná data ve skutečnosti ukazují, že blokování aktivity FGFBP1 blokuje degeneraci myelinu in vitro a omezuje metastázy a tvorbu PNI in vivo u myší.

Hydrogely s NP budou po ověření také implantovány přímo do pankreatu myší TPAC, což je nedávno vyvinutý model PDAC. Tvorba nádoru a PNI budeme monitorovat radiologicky (ultrazvuk a MRI) a histopatologickými analýzami.

SPRÁVA DAT Zdrojová data: Veškeré informace v originálních záznamech a ověřených kopiích originálních záznamů klinických nálezů, pozorování nebo jiných aktivit v klinické studii nezbytných pro rekonstrukci a vyhodnocení studie. Zdrojové údaje jsou obsaženy ve zdrojových dokumentech (originálech záznamů nebo ověřených kopiích). Jakákoli data zaznamenaná přímo na CRF (tj. žádný předchozí písemný nebo elektronický záznam dat) se považují za zdrojová data.

Zdrojové dokumenty: Původní dokumenty, data a záznamy (např. nemocniční záznamy; klinické a kancelářské diagramy; laboratorní poznámky; memoranda; deníky subjektů nebo kontrolní seznamy hodnocení; záznamy o výdeji lékáren; zaznamenaná data z automatických přístrojů; kopie nebo přepisy ověřené po ověření jako jsou to přesné kopie, mikrofiše, fotografické negativy, mikrofilmy nebo magnetická média, rentgenové snímky, předmětové soubory nebo záznamy uchovávané v lékárně, v laboratořích a na lékařsko-technických odděleních zapojených do klinické studie).

Všechny parametry požadované ve formuláři případové zprávy (CRF) budou zdokumentovány ve zdrojových dokumentech.

STATISTIKA Popis statistických metod Všechna vygenerovaná data budou sbírána náhodně (5 10X snímků shromážděných konfokálním mikroskopem) a hodnocena naslepo na vzorcích srovnatelné velikosti, zejména pro všechny analýzy in vitro. Na základě našich zkušeností používáme minimálně 5 biologických replikátů pro každý experiment in vitro. Budeme se tedy spoléhat na analýzy G-Power, abychom určili minimální velikost vzorku potřebnou k získání staticky významných výsledků s působivou biologickou hodnotou.

Na základě našich předchozích srovnatelných analýz bude rozložení dat považováno za normální. Všechny statistické analýzy budou provedeny na alespoň pěti různých experimentech. Statistické podrobné analýzy budou vyhodnoceny pomocí softwarového balíku Prism 9 (GraphPad) a běžně zahrnují: Mann-Whitney test, ANOVA, s upravenou Bonferroniho korekcí, analýzy nepárového t testu, obyčejná jednosměrná Anova, dvousměrná Anova, Tukeyho vícenásobný srovnávací test.

Všechna data generovaná během těchto postupů (jako jsou výsledky optimalizace a charakterizace získané jako funkce procesních parametrů pro přípravu hydrogelu a nanočástic) budou shromažďována a ukládána prostřednictvím vyhrazených úložišť (např. výzkumné datové úložiště Zenodo) a na médiích pro ukládání dat (Dropbox Business ).