Trattamenti terapeutici innovativi per inibire l'invasione perineurale nell'adenocarcinoma pancreatico (PNIPDAC)

PROGETTAZIONE DELLO STUDIO L'obiettivo generale di questo progetto è sviluppare nuovi approcci terapeutici per limitare la formazione di PNI e quindi la formazione e le metastasi di PDAC. La PNI ha la sua maggiore incidenza nel PDAC, in cui costituisce un riconosciuto fattore di rischio di scarsa sopravvivenza. Considerando la rilevanza clinica della PNI e il suo ruolo nel PDAC, è urgente identificare le firme molecolari della PNI per sviluppare nuove strategie terapeutiche. Recentemente abbiamo identificato una molecola (FGFBP1) che viene attivata nelle cellule tumorali del pancreas e avvia la PNI.

Questo progetto è concepito come uno studio osservazionale multicentrico e trasversale. L'OSR è l'unico centro che arruola pazienti. OSR invierà gli organoidi derivati ​​da campioni biologici dei pazienti arruolati al centro partecipante UO 3 (ASL3 Lecce) che effettuerà analisi proteomiche per determinare il livello di espressione dell'inibitore di FGFBP1 caricato in nanoparticelle idrogel. Pertanto, genereremo e valideremo l'efficacia di idrogel caricato con NP contenente inibitori di FGFBP1 e sviluppato dal CNR Nanotec Lecce (Obiettivo 1, UO 2), il cui rilascio biochimico sarà testato mediante spettrometria di massa da UO 3 ASL3 Lecce; convalideremo la loro efficacia biologica su coculture neuronali di cellule mielinizzate di Schwann seminate con organoidi umani contenenti idrogel caricati con NP (Obiettivo 2 - OSR), e in vivo in topi TPAC, un modello animale di PDAC recentemente sviluppato, al cui pancreas verrà iniettato NP -idrogel caricati (Obiettivo 3 - OSR).

Durata dello studio Durata dell'arruolamento: 18 mesi Durata del follow-up totale: nessun follow-up necessario per i pazienti arruolati Durata del periodo totale dello studio: 24 mesi

POPOLAZIONE DELLO STUDIO Partecipanti allo studio Pazienti adulti sottoposti a resezione chirurgica del pancreas, come da pratica clinica, con diagnosi clinicamente e radiologicamente confermata di adenocarcinoma duttale. Tutti i pazienti saranno arruolati presso l'Unità di Chirurgia Pancreatica e Trapianti dell'OSR.

Criteri di inclusione

• Età >18 anni (possono essere inclusi anche i pazienti fertili)
• Resezione chirurgica per sospetto PDAC, come da pratica clinica. Utilizzeremo questo materiale sia per i controlli che per i campioni dei casi.

Criteri di esclusione

• Pazienti < 18 anni di età
• Pazienti che non sono in grado di firmare un consenso informato
• Pazienti con sospetto PDAC non confermato al referto patologico Fallimenti di screening I partecipanti che hanno acconsentito a partecipare allo studio clinico, che non soddisfano uno o più criteri richiesti per la partecipazione allo studio durante le procedure di screening, sono considerati fallimenti di screening.

OGGETTO DI STUDIO Descrizione dell'oggetto di studio

Questo è uno studio osservazionale che non richiede ulteriori procedure sperimentali per i pazienti arruolati.

Tutti i pazienti saranno trattati secondo le linee guida indipendentemente dalla loro decisione di partecipare allo studio. Tutti i pazienti che parteciperanno firmeranno il modulo di consenso informato allegato al presente protocollo.

Nell'Obiettivo 1 (non è richiesto materiale umano), l'UO 2 (CNR-Nanotech Lecce) svilupperà e caratterizzerà idrogel caricati con NP in grado di rilasciare inibitori di FGFBP1. Gli idrogel saranno caratterizzati mediante reometria, test meccanici, analisi morfologiche, test di permeabilità/diffusione, test di rigonfiamento e test di stabilità/degradazione in condizioni fisiologiche. Studi cellulari (vitalità, morfologia, motilità, proliferazione) consentiranno di valutare l'interazione tra idrogel e cellule pancreatiche murine per selezionare le composizioni più performanti.

Le nanoparticelle ottenute verranno caratterizzate: la loro carica superficiale, il diametro idrodinamico, la distribuzione delle particelle e la loro stabilità in tamponi biologici verranno monitorate mediante tecnica di light scattering. La morfologia delle nanoparticelle sarà studiata utilizzando sia la microscopia elettronica a scansione che quella a trasmissione. Il caricamento ed i profili di rilascio degli inibitori di FGFBP1 sotto diversi stimoli saranno monitorati mediante tecniche analitiche avanzate (separazioni cromatografiche e rilevazione mediante spettroscopia di massa). La biocompatibilità delle migliori nanoformulazioni sarà valutata eseguendo saggi di vitalità, saggi di attività proinfiammatoria, monitoraggio del ciclo cellulare, saggi di emolisi. Queste indagini saranno effettuate grazie alla disponibilità di strumentazione come citometro a flusso, lettore di piastre multimodale e microscopia confocale a scansione laser abbinata a strutture per colture cellulari. L'effettivo rilascio dell'inibitore di FGFBP1 sarà testato mediante analisi di spettrometria di massa da parte dell'UO 3 ASL3 di Lecce utilizzando saggi di spettroscopia di massa.

Nell'Obiettivo 2 l'UO 1 (OSR) genererà organoidi umani e murini da pazienti arruolati per procedura chirurgica dopo diagnosi confermata di PDAC e da topi TPAC, rispettivamente.

Gli organoidi ricapitolano l'architettura epiteliale del loro organo di origine e riproducono i segnali ambientali presenti sia nel tessuto normale che nel cancro, pur mantenendo le mutazioni genetiche originali (Lau et al, 2020).

Prepareremo organoidi pancreatici umani da pazienti con PDAC la cui diagnosi è stata confermata clinicamente e radiologicamente. I pazienti verranno informati e verrà chiesto loro di firmare un consenso per la raccolta dei tessuti. I campioni asportati, raccolti in condizioni sterili, verranno trasferiti al patologo per una caratterizzazione istologica preliminare. Dopo aver isolato il tumore, il patologo ce ne fornirà una piccola parte che conserveremo in una provetta sterile da 50 mL in presenza di terreno basale a 4°C per 16 ore per eliminare il grasso e le cellule del sangue. Successivamente, separeremo le cellule dal tessuto fibroso circostante mediante dissezione meccanica seguita da digestione enzimatica con 0,125 mg/ml di collagenasi, 0,125 mg/ml di dispasi e 0,125 mg/ml di DNAasi. Per rimuovere il materiale non digerito, lo passeremo attraverso un colino cellulare da 40 μm. Tutto il materiale raccolto verrà quindi centrifugato, risospeso in Matrigel freddo e piastrato in piastre di coltura a 4 pozzetti preriscaldate.

Prepareremo anche organoidi murini dal pancreas di topi TPAC, un modello animale recentemente sviluppato che sviluppa PDAC e PNI a partire dai 12 mesi di età e riproduce fedelmente le caratteristiche del cancro umano.

Sia il tessuto umano che quello murino verranno prima dissociati meccanicamente e poi digeriti enzimaticamente per ottenere singole cellule. Come controllo prepareremo organoidi naïve e organoidi incorporati in idrogel privi di inibitore di FGFBP1. Tutte le cellule verranno risospese in Matrigel freddo e piastrate in piastre di coltura preriscaldate da 4 pozzetti.

Stabiliremo anche organoidi provenienti da pancreas murino del modello animale TPAC caratterizzato da un'estesa PNI nel PDAC e da pancreas murino sano, come controllo.

Per validare l'efficacia dell'idrogel a base di NP, sviluppato dall'UO 1 CNR Nanotec Lecce, nel bloccare l'espressione di FGFBP1 e limitare la formazione di PNI nel PDAC, eseguiremo prima analisi proteomiche (UO 3 ASL3 Lecce) per monitorare l'effettivo rilascio dell'inibitore. .

Determineremo anche l'effettiva inibizione della segnalazione di FGFBP1 negli organoidi caricati con idrogel inibitori di FGFBP1 e relativi controlli mediante qRT-PCR (mRNA) e analisi Western Blotting (proteine) esaminando specifici effettori di segnalazione a valle. Monitoreremo anche l'effetto degli idrogel che rilasciano l'inibitore di FGFBP1 sulla crescita e formazione degli organoidi mediante microscopio elettronico a scansione e mediante analisi di immunofluorescenza per CK19, un marcatore delle cellule duttali esocrine e Sox 9, un marcatore della linea duttale delle neoplasie pancreatiche. Successivamente, stabiliremo coculture neuronali di cellule di Schwann da neuroni dei gangli della radice dorsale del topo E13.5 come in (Taveggia e Bolino 2018), le incorporeremo in Matrigel per mantenere condizioni di coltura comparabili con gli organoidi e lasceremo che le colture mielinizzino per 21 giorni nel presenza di 50 ug/ml di acido ascorbico. I nostri dati preliminari indicano che gli organoidi PDAC seminati su coculture mielinizzate inducono una rapida ed estesa degenerazione della mielina, valutata mediante colorazione MBP. Inoltre, questo evento viene rapidamente bloccato se gli organoidi PDAC non esprimono FGFBP1. Pertanto, semineremo organoidi umani e di topo contenenti idrogel NP inibitori di FGFBP1 e relativi controlli, su coculture neuronali di cellule di Schwann mielinizzate. Manterremo le colture per ulteriori 3, 7, 10, 15 e 21 giorni e monitoreremo l'entità della mielinizzazione e dell'integrità assonale mediante analisi di immunofluorescenza per MBP e NF.

Poiché nei nostri dati preliminari il blocco della segnalazione di FGFBP1 salva la mielinizzazione, ci aspettiamo che le coculture mielinizzate neuronali a contatto con organoidi caricati con idrogel NP che rilasciano l'inibitore di FGFBP1 non degenerino a differenza dei controlli. Di particolare interesse sarà confrontare le possibili differenze tra organoidi derivati ​​dall'uomo e dai topi.

Nell'Obiettivo 3 (non è richiesto materiale umano), l'UO 1 inietterà nel pancreas dei topi TPAC, un modello animale recentemente sviluppato per PDAC, idrogel caricati con NP che rilasciano l'inibitore di FGFB1.

Valuteremo innanzitutto il livello di espressione di FGFBP1 a livello di mRNA e proteine. e l'espressione di CK19 e Sox 9 (cellule tumorali), NF 200 (assoni) e GFAP (SC). Tutte le analisi saranno effettuate su 5 topi/gruppo per raggiungere la significatività statistica. Parallelamente, valuteremo anche i livelli di espressione di queste proteine ​​mediante analisi Western Blotting seguendo protocolli standard. Per validare l'efficacia degli idrogel caricati con NP che trasportano l'inibitore di FGFBP1, li inseriremo direttamente nella coda del parenchima pancreatico dei topi TPAC, mediante procedure chirurgiche. In parallelo, inietteremo idrogel non contenenti nanoparticelle nel pancreas dei topi TPAC che fungeranno da controlli negativi. Monitoreremo la formazione del tumore mediante analisi ecografiche 10, 20, 30, 40 e 50 giorni dopo l'iniezione di idrogel. I topi positivi per la formazione di tumore verranno sottoposti ad analisi MRI presso l'OSR Preclinical Imaging Facility per determinare la presenza di metastasi negli organi vicini (fegato/peritoneo). Alla fine di ogni time point, i topi verranno sacrificati, perfusi in PFA al 4% e l'intera cavità addominale inclusa nell'OCT per analizzare le caratteristiche istologiche del tumore primario e valutare la presenza di PNI nei tronchi nervosi posteriori e nei gangli. Sezioni trasversali spesse 12 μm verranno tagliate al criostato, raccolte su vetrini Superfrost plus e processate per la colorazione con ematossilina ed eosina e l'immunofluorescenza per CK 19, Sox 9 (cellule tumorali) e NF200 (assoni). Anche milza, duodeno, stomaco, fegato, reni, polmoni, peritoneo e diaframma verranno raccolti in formalina tamponata al 10%, incorporati in cera di paraffina e sezioni da 3 μm colorate con ematossilina ed eosina per rilevare la formazione di metastasi.

PROCEDURE DI STUDIO Tutte le visite di studio saranno eseguite secondo la pratica clinica corrente. Non verranno eseguite procedure aggiuntive.

Consenso informato Il consenso informato è un processo che viene avviato prima che l'individuo accetti di partecipare allo studio e continua per tutta la durata della partecipazione allo studio. I moduli di consenso saranno approvati dalla CE e al partecipante verrà chiesto di leggere e rivedere il documento. Lo sperimentatore (secondo i requisiti normativi applicabili) o una persona designata dallo sperimentatore, e sotto la responsabilità dello sperimentatore, spiegherà lo studio di ricerca al partecipante e risponderà a qualsiasi domanda che possa sorgere. Verrà fornita una spiegazione verbale in termini adatti alla comprensione da parte del partecipante delle finalità, delle procedure e dei potenziali rischi dello studio e dei suoi diritti come partecipanti alla ricerca. I partecipanti avranno l'opportunità di rivedere attentamente il modulo di consenso scritto e porre domande prima di firmarlo. I partecipanti dovrebbero avere l'opportunità di discutere lo studio con la propria famiglia o chi ne fa le veci o di pensarci prima di accettare di partecipare. I partecipanti devono essere informati che la partecipazione è volontaria e che possono ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento, senza pregiudizio. Una copia del documento di consenso informato sarà consegnata ai partecipanti per la loro documentazione. Il processo di consenso informato sarà condotto e documentato nel documento originale (compresa la data) e nel modulo firmato, prima che il partecipante venga sottoposto a qualsiasi procedura specifica dello studio/raccolta di dati. I diritti e il benessere dei partecipanti saranno tutelati sottolineando loro che la qualità delle loro cure mediche non sarà influenzata negativamente se rifiutano di partecipare a questo studio.

Reclutamento e screening dei soggetti Tutti i pazienti candidati all'intervento chirurgico per PDAC saranno considerati idonei per l'arruolamento nel presente studio. L'obiettivo ottimale sarebbe reclutare almeno 50 pazienti nel periodo di studio (arruolamento di 18 mesi). Identificazione del soggetto Verrà assegnato consecutivamente un codice identificativo del soggetto (es.: PNI_XXX; XXX è il numero progressivo del soggetto in ordine crescente a partire da 001).

Verrà conservato un elenco identificativo dei pazienti. Valutazioni di base Le procedure di base coincidono con la firma del consenso informato per la partecipazione allo studio. Trattandosi infatti di uno studio trasversale non sono previste altre procedure ad hoc per il paziente partecipante.

Definizione di fine dello studio Secondo il disegno dello studio, la fine dello studio è definita quando l'ultimo paziente è stato valutato e si concluderanno tutti gli esperimenti in vitro e in vivo.

Interruzione anticipata o sospensione di uno studio Questo studio può essere temporaneamente sospeso o interrotto anticipatamente dal rappresentante autorizzato dello Sponsor o dal PI in qualsiasi sito se esiste una causa ragionevole e sufficiente. Una notifica scritta, documentante il motivo della sospensione o della conclusione dello studio, sarà fornita dalla parte che sospende o interrompe lo studio ai partecipanti allo studio, al ricercatore, all'agenzia di finanziamento e alle autorità di regolamentazione. Nel terminare lo studio, lo Sponsor e il Ricercatore principale garantiranno che venga data un'adeguata considerazione alla tutela degli interessi dei soggetti.

INTERRUZIONE E RITIRO I partecipanti sono liberi di recedere dalla partecipazione allo studio in qualsiasi momento su richiesta.

TRATTAMENTO DEI CAMPIONI Idrogel caricati NP che rilasciano inibitori di FGFBP1 saranno sviluppati dall'UO 2 CNR Nanotec Lecce.

L'UO 1 preparerà organoidi derivati ​​dall'uomo e dal topo contenenti idrogel caricati con NP che rilasciano inibitori di FGFBP1. L'UO 3, ASL3 Lecce, determinerà l'effettivo rilascio degli inibitori di FGFBP1 negli organoidi mediante analisi proteomiche.

Stabiliremo organoidi da pazienti con PDAC resecati chirurgicamente la cui diagnosi di adenocarcinoma duttale è stata confermata sia clinicamente che radiologicamente presso l'Unità di Chirurgia Pancreatica e dei Trapianti dell'OSR. Gli organoidi verranno stabiliti presso il laboratorio dell'Axo-Glial Interaction Unit (all'interno dell'OSR). Tutti gli organoidi di origine umana e murina saranno conservati presso l'OSR CRB e nel laboratorio dell'Unità di interazione Axo-Gliale dell'OSR per studi futuri, ad eccezione di parte di e quelli contenenti idrogel caricati con NP che saranno inviati all'ASL3, Lecce, per l'analisi proteomica per convalidare il rilascio efficace dell'inibitore FGFBP1. Dopo le analisi, che dureranno circa 2 settimane, tutti gli organoidi inviati ai campioni dell'ASL3 Lecce torneranno all'OSR e distrutti.

Gli organoidi sviluppati che trasportano idrogel caricati con NP saranno validati in vitro su coculture mieliniche neuronali di cellule di Schwann per la loro efficacia nel limitare/bloccare la degenerazione mielinica. I nostri dati preliminari infatti indicano che il blocco dell’attività di FGFBP1 blocca la degenerazione della mielina in vitro e limita le metastasi e la formazione di PNI in vivo nei topi.

Gli idrogel caricati con NP, previa validazione, verranno anche impiantati direttamente nel pancreas dei topi TPAC, un modello di PDAC recentemente sviluppato. Monitoreremo la formazione del tumore e del PNI radiologicamente (ultrasuoni e risonanza magnetica) e mediante analisi istopatologiche.

GESTIONE DEI DATI Dati di origine: tutte le informazioni contenute nelle registrazioni originali e nelle copie certificate delle registrazioni originali di risultati clinici, osservazioni o altre attività in uno studio clinico necessarie per la ricostruzione e la valutazione dello studio. I dati di origine sono contenuti nei documenti di origine (documenti originali o copie certificate). Tutti i dati registrati direttamente sulle CRF (ovvero, nessuna precedente registrazione scritta o elettronica dei dati), sono considerati dati di origine.

Documenti originali: documenti, dati e registrazioni originali (ad esempio, cartelle cliniche, cartelle cliniche e ambulatoriali, appunti di laboratorio, memorandum, diari dei soggetti o liste di controllo di valutazione, registri di dispensazione di farmacie, dati registrati da strumenti automatizzati, copie o trascrizioni certificate dopo la verifica come ovvero copie accurate, microfiche, negativi fotografici, microfilm o supporti magnetici, radiografie, fascicoli soggettivi o registrazioni conservate presso la farmacia, presso i laboratori e presso i reparti medico-tecnici coinvolti nello studio clinico).

Tutti i parametri richiesti nel modulo di segnalazione del caso (CRF) saranno documentati nei documenti di origine.

STATISTICHE Descrizione dei metodi statistici Tutti i dati generati saranno raccolti in modo casuale (5 immagini 10X raccolte al microscopio confocale) e valutati in cieco su campioni di dimensioni comparabili, in particolare per tutte le analisi in vitro. Sulla base della nostra esperienza utilizziamo un minimo di 5 repliche biologiche per ciascun esperimento in vitro. Pertanto, faremo affidamento sulle analisi G-Power per determinare la dimensione minima del campione richiesta per ottenere risultati staticamente significativi con un valore biologico di grande impatto.

Sulla base delle nostre precedenti analisi comparabili, si presumerà che la distribuzione dei dati sia normale. Tutte le analisi statistiche saranno eseguite su almeno cinque diversi esperimenti. Le analisi statistiche dettagliate saranno valutate utilizzando il pacchetto software Prism 9 (GraphPad) e normalmente comprenderanno: test di Mann-Whitney, ANOVA, con correzione di Bonferroni aggiustata, analisi del test t non accoppiato, Ordinary OneWay Anova, Two-Way Anova, test di confronto multiplo di Tukey.

Tutti i dati generati durante queste procedure (come i risultati di ottimizzazione e caratterizzazione ottenuti in funzione dei parametri di processo per la preparazione di idrogel e nanoparticelle) saranno raccolti e archiviati attraverso repository dedicati (ad esempio, repository di dati di ricerca Zenodo) e su supporti di archiviazione dati (Dropbox Business ).