Innovative terapeutiske behandlinger til at hæmme perineural invasion i bugspytkirtel adenokarcinom (PNIPDAC)

STUDIEDESIGN Det overordnede mål med dette projekt er at udvikle nye terapeutiske tilgange til at begrænse PNI-dannelse og dermed PDAC-dannelse og metastaser. PNI, har sin højere forekomst i PDAC, hvor det er en anerkendt risikofaktor for dårlig overlevelse. I betragtning af den kliniske relevans af PNI og dens rolle i PDAC, er det presserende at identificere molekylære PNI-signaturer for at udvikle nye terapeutiske strategier. Vi har for nylig identificeret et molekyle (FGFBP1), der aktiveres i bugspytkirtelkræftceller og initierer PNI.

Dette projekt er designet som en observationel multicentrisk, tværsnitsundersøgelse. OSR er det eneste center, der indskriver patienter. OSR vil sende organoider afledt af biologiske prøver af indskrevne patienter til det deltagende center UO 3 (ASL3 Lecce), der vil udføre proteomiske analyser for at bestemme niveauet af ekspression af FGFBP1-hæmmer, der er fyldt i nanopartikler-hydrogeler. Således vil vi generere og validere effektiviteten af ​​NP-ladet hydrogel, der bærer FGFBP1-hæmmere og udviklet af CNR Nanotec Lecce (Mål 1, UO 2), hvis biokemiske frigivelse vil blive testet ved massespektrometri af UO 3 ASL3 Lecce; vi vil validere deres biologiske effektivitet på myeliniserede Schwann-cellers neuronale cokulturer podet med humane organoider, der bærer NP-ladede hydrogeler (Mål 2 - OSR), og in vivo i TPAC-mus, en nyligt udviklet dyremodel af PDAC, hvis bugspytkirtel vil blive injiceret med NP -ladede hydrogeler (Mål 3 - OSR).

Undersøgelsesvarighed Varighed af indskrivning: 18 måneder Varighed af total opfølgning: ingen opfølgning nødvendig for indrullerede patienter Varighed af samlet undersøgelsesperiode: 24 måneder

UNDERSØGELSESPOPULATION Undersøgelsesdeltagere Voksne patienter, der gennemgår kirurgisk pancreasresektion, i henhold til klinisk praksis, med klinisk og radiologisk bekræftet diagnose af duktalt adenokarcinom. Alle patienter vil blive indskrevet på OSR Pancreatic and Transplant Surgery Unit.

Inklusionskriterier

• Alder >18 år (også fertile patienter kan inkluderes)
• Kirurgisk resektion for mistanke om PDAC i henhold til klinisk praksis. Vi vil bruge dette materiale både til kontroller og til caseprøverne.

Eksklusionskriterier

• Patienter < 18 år
• Patienter, der ikke er i stand til at underskrive et informeret samtykke
• Patienter med mistanke om PDAC, som ikke er bekræftet ved patologisk rapport. Screeningsfejl Deltagere, der har givet samtykke til at deltage i den kliniske undersøgelse, og som ikke opfylder et eller flere kriterier, der kræves for deltagelse i undersøgelsen under screeningsprocedurerne, betragtes som screeningsfejl.

STUDIEOBJEKT Studieobjektbeskrivelse

Dette er en observationsundersøgelse, som ikke kræver yderligere eksperimentelle procedurer for de indskrevne patienter.

Alle patienter vil blive behandlet i henhold til retningslinjer uanset deres beslutning om at deltage i undersøgelsen. Alle patienter, der deltager, vil underskrive den informerede samtykkeformular, der er knyttet til denne protokol.

I mål 1 (intet humant materiale påkrævet), vil UO 2 (CNR-Nanotech Lecce) udvikle og karakterisere NP-ladede hydrogeler, der er i stand til at frigive FGFBP1-hæmmere. Hydrogeler vil blive karakteriseret ved reometri, mekanisk test, morfologisk analyse, permeabilitets/diffusionstest, hævelse og stabilitet/nedbrydningstest under fysiologiske forhold. Celleundersøgelser (levedygtighed, morfologi, motilitet, proliferation) vil gøre det muligt at evaluere interaktionen mellem hydrogeler og murine pancreasceller for at vælge de bedst præsterende sammensætninger.

Opnåede nanopartikler vil blive karakteriseret: deres overfladeladning, hydrodynamiske diameter, partikelfordeling og deres stabilitet i biologiske buffere vil blive overvåget via lysspredningsteknik. Nanopartiklers morfologi vil blive studeret ved hjælp af både scannings- og transmissionselektronmikroskopi. FGFBP1-hæmmere belastning og frigivelsesprofiler under forskellige stimuli vil blive overvåget ved avancerede analytiske teknikker (kromatografiske separationer og påvisning ved massespektroskopi). Biokompatibiliteten af ​​de bedste nanoformuleringer vil blive vurderet ved at udføre levedygtighedsassays, pro-inflammatoriske aktivitetsassays, cellecyklusovervågning, hæmolyseassay. Disse undersøgelser vil blive udført takket være tilgængeligheden af ​​instrumentering som flowcytometer, multimode pladelæser og laserscanning konfokal mikroskopi koblet med cellekulturfacilitet. Effektiv frigivelse af FGFBP1-hæmmere vil blive testet ved massespektrometrianalyser med UO 3 ASL3 Lecce ved brug af massespektroskopi-assays.

I mål 2 vil UO 1 (OSR) generere humane og murine organoider fra patienter indskrevet til kirurgisk indgreb efter bekræftet diagnose af henholdsvis PDAC og fra TPAC mus.

Organoider rekapitulerer epitelarkitekturen af ​​deres oprindelsesorgan og reproducerer de miljømæssige signaler, der er til stede i både normalt væv og cancer, mens de bibeholder de originale genetiske mutationer (Lau et al, 2020).

Vi vil forberede humane bugspytkirtelorganoider fra PDAC-patienter, hvis diagnose er blevet bekræftet klinisk og radiologisk. Patienterne vil blive informeret og bedt om at underskrive et samtykke til vævsindsamling. Resekerede prøver, indsamlet under sterile forhold, vil blive overført til patologen for en foreløbig histologisk karakterisering. Efter at have isoleret tumoren, vil patologen give os en lille del af den, som vi vil opbevare i et 50 ml sterilt rør i nærværelse af basalt medium ved 4°C i 16 timer for at fjerne fedt og blodceller. Dernæst vil vi adskille celler fra det omgivende fibrøse væv ved mekanisk dissektion efterfulgt af enzymatisk fordøjelse med 0,125 mg/ml collagenase, 0,125 mg/ml dispase og 0,125 mg/ml DNAase. For at fjerne det ufordøjede materiale vil vi føre det gennem en 40 μm cellesi. Alt opsamlet materiale vil derefter blive centrifugeret, resuspenderet i kold Matrigel og plade i forvarmede 4-brønds kulturplader.

Vi vil også forberede murine organoider fra bugspytkirtlen hos TPAC-mus, en nyligt udviklet dyremodel, der udvikler PDAC og PNI fra 12 måneders alderen og trofast gengiver træk ved menneskelig cancer.

Både humant og muse-opsamlet væv vil først blive mekanisk dissocieret og derefter enzymatisk fordøjet for at opnå enkelte celler. Som kontrol vil vi enten forberede naive organoider og organoider indlejret med hydrogeler aflæsset med FGFBP1-hæmmer. Alle celler resuspenderes i kold Matrigel og udplades i forvarmede kulturplader med 4 brønde.

Vi vil også etablere organoider fra murin bugspytkirtel af TPAC-dyremodellen karakteriseret ved omfattende PNI i PDAC og fra rask murin bugspytkirtel som kontrol.

For at validere effektiviteten af ​​NP-ladet hydrogel-baseret, udviklet af UO 1 CNR Nanotec Lecce, til at blokere FGFBP1-ekspression og begrænse PNI-dannelse i PDAC, vil vi først udføre proteomiske analyser (UO 3 ASL3 Lecce) for at overvåge effektiv frigivelse af inhibitoren .

Vi vil også bestemme effektiv inhibering af FGFBP1-signalering i organoider fyldt med FGFBP1-hæmmerhydrogeler og relative kontroller ved qRT-PCR (mRNA) og Western Blotting-analyser (protein) ved at se på specifikke downstream-signaleffektorer. Vi vil også overvåge virkningen af ​​hydrogeler, der frigiver FGFBP1-hæmmer på organoiders vækst og dannelse ved scanning-elektronmikroskop og ved immunfluorescensanalyser for CK19, en markør for eksokrine ductale celler og Sox 9, en markør for ductal lineage af pancreas-neoplasmer. Dernæst vil vi etablere Schwann-cellers neuronale cokulturer fra E13.5 muse dorsale rodganglierneuroner som i (Taveggia og Bolino 2018), indlejre dem i Matrigel for at opretholde sammenlignelige dyrkningsbetingelser med organoider og lade kulturerne myelinere i 21 dage i tilstedeværelse af 50 ug/ml ascorbinsyre. Vores foreløbige data indikerer, at PDAC-organoider podet på myeliniserede cokulturer inducerer hurtig og omfattende myelindegeneration som vurderet ved MBP-farvning. Desuden blokeres denne hændelse hurtigt, hvis PDAC-organoider ikke udtrykker FGFBP1. Således vil vi udså menneske- og museorganoider indeholdende FGFBP1-hæmmer NP-hydrogeler og relative kontroller på myelinerede Schwann-cellers neuronale cokulturer. Vi vil vedligeholde kulturerne i yderligere 3, 7, 10, 15 og 21 dage og overvåge omfanget af myelinisering og af aksonal integritet ved immunfluorescensanalyser for MBP og NF.

Da blokering af FGFBP1-signalering i vores foreløbige data redder myelinisering, forventer vi, at neuronale myelinerede cokulturer i kontakt med organoider fyldt med NP-hydrogeler, der frigiver FGFBP1-hæmmer, ikke vil degenerere i modsætning til kontroller. Af særlig interesse vil det være at sammenligne mulige forskelle mellem menneskelige - og mus-afledte organoider.

I mål 3 (intet humant materiale påkrævet), vil UO 1 injicere i bugspytkirtlen på TPAC-mus, en nyligt udviklet dyremodel for PDAC, NP-ladede hydrogeler, der frigiver FGFB1-hæmmer.

Vi vil først vurdere ekspressionsniveauet af FGFBP1 på mRNA og proteinniveau. og ekspressionen af ​​CK19 og Sox 9 (cancerceller), NF 200 (axoner) og GFAP (SC'er). Alle analyser vil blive udført på 5 mus/gruppe for at nå statistisk signifikans. Parallelt hermed vil vi også evaluere ekspressionsniveauerne af disse proteiner ved Western Blotting-analyser efter standardprotokoller. For at validere effektiviteten af ​​NP-ladede hydrogeler, der bærer FGFBP1-hæmmer, vil vi indsætte dem direkte i halen af ​​bugspytkirtlens parenkym af TPAC-mus ved kirurgiske procedurer. Parallelt hermed vil vi injicere hydrogeler, der ikke indeholder nanopartikler, i bugspytkirtlen på TPAC-mus, der vil tjene som negative kontroller. Vi vil overvåge tumordannelse ved ultralydsanalyser 10-, 20-, 30- 40- og 50-dage efter hydrogel-injektion. Mus, der er positive for tumordannelse, vil gennemgå MR-analyser på OSR Preclinical Imaging Facility for at bestemme tilstedeværelsen af ​​metastaser i nære organer (lever / peritoneum). Ved slutningen af ​​hvert tidspunkt vil mus blive aflivet, perfunderet i 4% PFA og hele bughulen inkluderet i OCT for at analysere de histologiske karakteristika af den primære tumor og vurdere tilstedeværelsen af ​​PNI i de bageste nervestammer og ganglier. 12 μm tykke tværsnit vil blive skåret ved kryostaten, opsamlet på Superfrost plus-glasglas og behandlet til hæmatoxylin- og eosinfarvning og immunfluorescens for CK 19, Sox 9 (kræftceller) og NF200 (axoner). Milt, tolvfingertarm, mave, lever, nyrer, lunger, peritoneum og mellemgulv vil også blive opsamlet i 10 % bufret formalin, indlejret i paraffinvoks og 3 μm sektioner farvet med hæmatoxylin og eosinfarvning for at påvise metastasedannelse.

STUDIEPROCEDURER Alle undersøgelsesbesøg vil blive udført i overensstemmelse med gældende klinisk praksis. Der vil ikke blive udført yderligere procedurer.

Informeret samtykke Informeret samtykke er en proces, der påbegyndes forud for den enkeltes samtykke til at deltage i undersøgelsen og fortsætter under den enkeltes undersøgelsesdeltagelse. Samtykkeformularer vil være EF-godkendte, og deltageren vil blive bedt om at læse og gennemgå dokumentet. Investigatoren (i henhold til gældende lovkrav) eller en person, der er udpeget af investigatoren og under investigatorens ansvar, vil forklare forskningsundersøgelsen til deltageren og besvare eventuelle spørgsmål, der måtte opstå. En mundtlig forklaring vil blive givet i vendinger, der passer til deltagerens forståelse af formålene, procedurerne og potentielle risici ved undersøgelsen og af deres rettigheder som forskningsdeltagere. Deltagerne vil have mulighed for omhyggeligt at gennemgå den skriftlige samtykkeformular og stille spørgsmål, inden de underskriver. Deltagerne skal have mulighed for at diskutere undersøgelsen med deres familie eller surrogater eller tænke over det, inden de accepterer at deltage. Deltagerne skal informeres om, at det er frivilligt at deltage, og at de til enhver tid kan trække sig fra undersøgelsen uden fordomme. En kopi af det informerede samtykke vil blive givet til deltagerne til deres optegnelser. Processen med informeret samtykke vil blive gennemført og dokumenteret i kildedokumentet (inklusive datoen), og formularen underskrives, før deltageren gennemgår en undersøgelsesspecifik procedure/data indsamles. Deltagernes rettigheder og velfærd vil blive beskyttet ved at understrege over for dem, at kvaliteten af ​​deres lægebehandling ikke vil blive negativt påvirket, hvis de afslår at deltage i denne undersøgelse.

Emnerekruttering og screening Alle kirurgisk kandidatpatienter til PDAC vil blive betragtet som kvalificerede til at tilmelde sig denne undersøgelse. Det optimale mål ville være at rekruttere mindst 50 patienter i undersøgelsesperioden (18 måneders tilmelding) Emneidentifikation En emneidentifikationskode vil blive tildelt fortløbende (dvs.: PNI_XXX; XXX er det progressive emnenummer i stigende rækkefølge fra 001).

Der føres en patientidentifikationsliste. Baseline-vurderinger Baseline-procedurer falder sammen med underskrivelsen af ​​informeret samtykke til deltagelse i undersøgelsen. Da det faktisk er et tværsnitsstudie, er der ikke planlagt andre ad hoc-procedurer for undersøgelsen for den deltagende patient.

Definition af slutningen af ​​undersøgelsen Ifølge undersøgelsesdesignet defineres slutningen af ​​undersøgelsen som den sidste patient er blevet evalueret, og vi vil afslutte alle in vitro og in vivo eksperimenter.

For tidlig afslutning eller suspension af en undersøgelse Denne undersøgelse kan midlertidigt suspenderes eller for tidligt afsluttet af den autoriserede sponsorrepræsentant eller PI på et hvilket som helst sted, hvis der er tilstrækkelig rimelig grund. Skriftlig meddelelse, der dokumenterer årsagen til studiesuspendering eller afslutning, vil blive givet af den suspenderende eller afsluttende part til studiedeltagere, investigator, finansieringsbureau og regulerende myndigheder. Ved afslutning af undersøgelsen vil sponsoren og den primære efterforsker sikre, at der tages tilstrækkeligt hensyn til beskyttelsen af ​​forsøgspersonernes interesser.

AFBRYDELSE OG TILBAGETRÆKNING Deltagerne kan til enhver tid trække sig fra deltagelse i undersøgelsen efter anmodning.

PRØVEHÅNDTERING NP-ladede hydrogeler, der frigiver FGFBP1-hæmmere, vil blive udviklet af UO 2 CNR Nanotec Lecce.

UO 1 vil forberede menneske- og mus-afledte organoider, der bærer NP-ladede hydrogeler, der frigiver FGFBP1-hæmmere. UO 3, ASL3 Lecce, vil bestemme effektiv frigivelse af FGFBP1-hæmmere i organoider ved proteomiske analyser.

Vi vil etablere organoider fra kirurgisk reseceret PDAC-patienter, hvis diagnose af duktalt adenokarcinom blev bekræftet både klinisk og radiologisk på OSR Pancreatic and Transplant Surgery Unit. Organoider vil blive etableret på laboratoriet i Axo-Glial Interaction Unit (inden for OSR). Alle organoider af menneskelig og murin oprindelse vil blive opbevaret på OSR CRB og i laboratoriet for Axo-Glial interaktionsenhed på OSR til fremtidige undersøgelser, undtagen en del af og dem, der bærer NP-ladede hydrogeler, der vil blive sendt til ASL3, Lecce, til proteomisk analyse for at validere effektiv frigivelse af FGFBP1-hæmmeren. Efter analyserne, som vil vare cirka 2 uger, vil alle organoider sendt til ASL3 Leccesamples vende tilbage til OSR og destrueres.

Udviklede organoider, der bærer NP-ladede hydrogeler, vil blive valideret in vitro på Schwann-cellers neuronale myelinerede cokulturer for deres effektivitet i at begrænse/blokere myelin-degeneration. Vores foreløbige data indikerer faktisk, at blokering af FGFBP1-aktivitet blokerer myelin-degeneration in vitro og begrænser metastase og PNI-dannelse in vivo hos mus.

NP-ladede hydrogeler, efter validering, vil også blive implanteret direkte i bugspytkirtlen på TPAC-mus, en nyligt udviklet model af PDAC. Vi vil overvåge tumor- og PNI-dannelse radiologisk (ultralyd og MR) og ved histopatologiske analyser.

DATASTYRING Kildedata: Alle oplysninger i originale optegnelser og bekræftede kopier af originale optegnelser over kliniske fund, observationer eller andre aktiviteter i en klinisk undersøgelse, der er nødvendige for rekonstruktionen og evalueringen af ​​undersøgelsen. Kildedata er indeholdt i kildedokumenter (originale optegnelser eller bekræftede kopier). Alle data, der er registreret direkte på CRF'erne (dvs. ingen forudgående skriftlig eller elektronisk registrering af data), anses for at være kildedata.

Kildedokumenter: Originale dokumenter, data og optegnelser (f.eks. hospitalsjournaler; kliniske og kontorskemaer; laboratorienotater; memoranda; forsøgspersoners dagbøger eller evalueringstjeklister; apoteksudleveringsjournaler; registrerede data fra automatiserede instrumenter; kopier eller transskriptioner certificeret efter verifikation som være nøjagtige kopier, mikroficher, fotografiske negativer, mikrofilm eller magnetiske medier, røntgenbilleder, emnefiler eller optegnelser, der opbevares på apoteket, på laboratorierne og på de medicinsk-tekniske afdelinger, der er involveret i den kliniske undersøgelse).

Alle parametre, der efterspørges i sagsfremstillingsskemaet (CRF), vil blive dokumenteret i kildedokumenterne.

STATISTIK Beskrivelse af statistiske metoder Alle genererede data vil blive indsamlet tilfældigt (5 10X billeder indsamlet ved konfokalt mikroskop) og vurderet blindt på prøver af sammenlignelig størrelse, især for alle in vitro analyser. Baseret på vores erfaring bruger vi minimum 5 biologiske replikater for hvert in vitro-eksperiment. Vi vil således stole på G-Power-analyserne for at bestemme den mindste prøvestørrelse, der kræves for at opnå statisk signifikante resultater med en virkningsfuld biologisk værdi.

Baseret på vores tidligere sammenlignelige analyser vil datafordelingen antages at være normal. Alle statistiske analyser vil blive udført på mindst fem forskellige eksperimenter. Statistiske detaljerede analyser vil blive vurderet ved hjælp af Prism 9 Software-pakke (GraphPad) og omfatter normalt: Mann-Whitney test, ANOVA, med justeret Bonferroni korrektion, Unpaired t test analyser, Ordinary OneWay Anova, Two-Way Anova, Tukeys multiple sammenligningstest.

Alle data, der genereres under disse procedurer (såsom optimerings- og karakteriseringsresultater opnået som funktion af procesparametrene for hydrogel- og nanopartiklerforberedelse) vil blive indsamlet og lagret gennem dedikerede depoter (f.eks. Zenodo forskningsdatalager) og i datalagringsmedier (Dropbox Business) ).