Odhalení genů za nádory chrupavky a vaskulárními anomáliemi pomocí genomového sekvenování

Design studie:

Do studie bude v průběhu pěti let nábor a zařazení až 100 pacientů s Ollierovou chorobou (OD) a Maffucciho syndromem (MS). Každý účastník bude viděn v NIH Clinical Center (CC) na hospitalizační studijní návštěvu v délce 5 dnů nebo déle.

Během této návštěvy budou provedeny následující procedury: rentgenová absorpciometrie s duální energií (DXA), celotělový rentgen, magnetická rezonanční angiografie (MRA), celotělová pozitronová emisní tomografie (PET), magnetická rezonance zobrazování (MRI) a jednovoxelovou magnetickou rezonanční spektroskopii mozku. Poté, co je studijní tým uvidí na NIH CC, obdrží účastníci souhrn všech výsledků testů a konzultací dokončených v NIH.

Rodinní příslušníci zapsaní pro sekvenování genomu nepodstoupí žádná klinická hodnocení v NIH CC.

Dr. Gordon bude dohlížet na realizaci studie na NIH. Dr. Marini se podílela na původní žádosti o grant NIH a odešla do důchodu, ale ponechává si jmenování v NIH jako emeritní vědec/dobrovolnice. Dr. Marini bude pracovat na protokolu jako hlavní klinický konzultant a bude pracovat v NIH CC. Nesouhlasí s účastníky, ale bude přítomna na mnoha studijních návštěvách.

Členové studijního týmu JHU budou mít povolení pracovat a/nebo pozorovat v NIH; nebudou však považováni za součást studijního týmu NIH a nebudou identifikováni jako přidružení investigátoři NIH.

Cíle:

Ollierova nemoc (OD) a Maffucciho syndrom (MS) jsou charakterizovány mnohočetnými enchondromy, které vedou k závažným deformitám skeletu během raného dětství a zvýšenému riziku hondrosarkomů a dalších malignit. Pacienti s RS mají také cévní anomálie. Chondrosarkom je maligní nádor, který pochází z chrupavčitých buněk. Je to třetí nejčastější primární malignita kosti po myelomu a osteosarkomu. Tvoří asi 20 % kostních nádorů a ve Spojených státech je každý rok diagnostikován přibližně u 600 pacientů. Až 40 % chondrosarkomů vzniká z enchondromu. Riziko chondrosarkomu u OD je až 45,8 % a u RS až 57,1 %. V současnosti je jedinou léčbou pacientů s těmito poruchami chirurgická; neexistuje účinná farmakologická léčba.

Identifikovali jsme heterozygotní zárodečnou ztrátu funkčních variant v PTPN11 (kódující nereceptorovou proteinovou tyrosin fosfatázu SHP2) způsobující MC. V předběžných studiích jsme také identifikovali variantu PTPN11 R138X u retinformního hemangioendoteliomu pacienta s RS a zárodečnou variantu PTPN11 L560F u pacienta s OD. PTPN11 kóduje SHP2, cytosolickou protein tyrosin fosfatázu zapojenou do raného kroku signalizace RAS/MAPK downstream od několika receptorových tyrosin kináz včetně EGFR a FGFR. Pomocí imunoblotové analýzy jsme měřili expresi koncových produktů této dráhy, pERK1 a 2 ve fibroblastech od pacientů s MC a OD a pozorovali sníženou expresi pERK1 a 2 u pacientů ve srovnání s kontrolami (Sobreira et al., nepublikováno). Podobně experimenty na myších modelech s podmíněným knockoutem Ptpn11 ukázaly sníženou signalizaci ERK1/2 v chondrocytech postrádajících SHP2. Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že snížení signalizace RAS/MAPK může vést k tvorbě enchondromů. Heterozygotní somatické varianty IDH1 a 2 byly identifikovány v nádorech části pacientů s RS a OD. Žádná varianta nebyla identifikována v zárodečné DNA postižených jedinců. A naše předběžné studie identifikovaly zárodečné varianty KDM4C a HIF1A, 2 geny, o kterých je známo, že interagují s IDH1 a 2, jako kandidátní geny u 2 nepříbuzných probandů s mnohočetnými enchondromy.

Na základě těchto výsledků předpokládáme, že OD a RS jsou syndromy nádorové predispozice způsobené zárodečnými variantami, jako je neurofibromatóza typu 1 a schwannomatóza. Následné zásahy do stejných nebo různých genů, jako je IDH1 a IDH2 nebo jiných dosud identifikovaných genů, se podílejí na tvorbě enchondromů a chondrosarkomů. Navíc tyto varianty pravděpodobně down-regulují dráhu RAS/MAPK nebo jsou v genech, které interagují s IDH1 a 2.

Při testování tohoto modelu budeme sledovat následující konkrétní cíle:

Specifický cíl 1. Komplexně definovat fenotypové rysy pacientů s OD a RS.

Hypotéza: OD a RS jsou zřetelné, nedostatečně charakterizované syndromy náchylnosti k rakovině s různými rysy. Nedávno jsme navrhli diagnostické a sledovací pokyny pro systematické hodnocení pacientů s OD a MS9. Zde budeme: (a) identifikovat kompletní sadu fenotypových rysů charakteristických pro pacienty s OD a RS provedením podrobného posouzení jejich klinické a rodinné anamnézy a fyzických rysů na NIH/CC; (b) určit počet, velikost a umístění enchondromů a vaskulárních anomálií a identifikovat další nádory u těchto pacientů provedením celotělové MRI nebo rentgenového záření, MRA a magnetické rezonanční spektroskopie mozku; a (c) zřídit biobanku vzorků od pacientů a rodinných příslušníků pro genetické, metabolické a funkční testování.

Specifický cíl 2. Hledání chybějících zárodečných (a/nebo somatických mozaik) kauzativních variant (kódujících i nekódujících) v DNA z krve, enchondromů, chondrosarkomů a souvisejících hemangiomů. Provedeme WGS na zárodečné a nádorové (enchondromy, chondrosarkomy a hemangiomy) DNA, abychom identifikovali zárodečné varianty v krvi a následné zásahy podílející se na vzniku nádoru. Provedeme také sekvenování RNA (RNAseq) na RNA izolované ze vzorků nádoru, abychom provedli analýzu genové exprese a identifikovali další možné dráhy ovlivněné těmito poruchami; a na pomoc při interpretaci variant detekovaných WGS, zejména synonymních a nekódujících variant ovlivňujících sestřih a množství RNA, v daném pořadí.

Specifický cíl 3. Abychom otestovali hypotézu, že standardní analýza může přehlédnout kauzativní variantu kvůli alternativnímu způsobu dědičnosti, použijeme nové analytické přístupy, které zkoumají alternativní způsoby dědičnosti, které se obvykle neuvažují. Budeme zkoumat způsoby dědičnosti otcovských a mateřských imprintingů a zkoumat varianty identifikované v genech, které unikají X-inaktivaci. S WGS budeme také schopni zkoumat varianty v genech vázaných na X, které unikají inaktivaci X, a varianty v genech vázaných na Y.

Specifický cíl 4. Určit účinek kauzativních variant OD nebo MS v dráze HIF-1.

Hypotéza: Kauzativní varianty OD a MS způsobují downregulaci HIF1A a jeho cílových genů. Naše předběžná analýza dat RNAseq ze vzorků fibroblastů a enchondromů od pacientů s OD a MS ukázala narušenou indukci genů souvisejících s HIF-1 na rozdíl od jiných nastavení rakoviny. Varianty HIF1A nebyly identifikovány jako způsobující onemocnění, ale sedm našich pacientů má kauzativní variantu v tomto genu. Zjistili jsme, že HIF1A a VHL byly mutovány ve vyšší míře u pacientů s OD a MS ve srovnání s kontrolami (p<0,05). Proto: (a) použijeme modely založené na knock-in buňkách ke zkoumání účinku kauzativních variant, které jsme identifikovali u HIF1A (mutovaný u sedmi pacientů), VHL (mutovaný u šesti pacientů) a KDM4C (mutovaný u čtyř pacientů ) na transkripční aktivitu HIF-1 za použití duálního luciferázového testu40; a (b) identifikovat odlišně exprimované geny a narušené dráhy s enchondroma RNAseq.

Konkrétní cíl 5. Sdílení dat. Stejně jako v jiných projektech odešleme naše sekvenční data do dbGaP, abychom usnadnili sdílení dat. JHM IRB učiní rozhodnutí, že sdílení je v souladu s genomickou politikou NIH. Také k identifikaci ostatních s údaji relevantními pro naše kandidátské varianty a geny použijeme GeneMatcher a Matchmaker Exchange. Naše data také předáme do databáze ClinVar a COSMIC. Těšíme se na účast v konsorciu, které vytvoří Kids First Data Resource a celkový genetický soubor dat pro dětské rakoviny na NCI Genomic Data Commons.