Odkrywanie genów odpowiedzialnych za nowotwory chrząstki i anomalie naczyniowe za pomocą sekwencjonowania genomu

Projekt badania:

Do badania zostanie zrekrutowanych i włączonych do 100 pacjentów z chorobą Olliera (OD) i zespołem Maffucciego (SM) w ciągu pięciu lat. Każdy uczestnik zostanie przyjęty do Centrum Klinicznego NIH (CC) w ramach wizyty studyjnej w szpitalu trwającej 5 dni lub dłużej.

Podczas tej wizyty zostaną wykonane następujące procedury: absorpcjometria rentgenowska o podwójnej energii (DXA), RTG całego ciała, angiografia rezonansu magnetycznego (MRA), pozytonowa tomografia emisyjna całego ciała (PET), rezonans magnetyczny obrazowanie (MRI) i spektroskopia rezonansu magnetycznego pojedynczego woksela mózgu. Po wizycie zespołu badawczego w CC NIH uczestnicy otrzymają podsumowanie wszystkich wyników badań i konsultacji przeprowadzonych w NIH.

Członkowie rodziny zapisani do sekwencjonowania genomu nie będą poddawani żadnym badaniom klinicznym w NIH CC.

Doktor Gordon będzie nadzorował realizację badania w NIH. Doktor Marini brała udział w pierwotnym wniosku o grant NIH i przeszła na emeryturę, ale nadal pracuje w NIH jako emerytowana naukowiec/wolontariuszka. Doktor Marini będzie pracować nad protokołem jako starszy konsultant kliniczny i pracować w CC NIH. Nie wyrazi zgody na udział w badaniu, ale będzie obecna podczas wielu wizyt studyjnych.

Członkowie zespołu badawczego JHU będą mieli pozwolenie na pracę i/lub obserwację w NIH; nie będą oni jednak uważani za część zespołu badawczego NIH i nie będą identyfikowani jako współbadacze NIH.

Cele:

Choroba Olliera (OD) i zespół Maffucciego (MS) charakteryzują się licznymi enchondromami, które powodują poważne deformacje szkieletu we wczesnym dzieciństwie i zwiększają ryzyko mięsaka chłonnego i innych nowotworów złośliwych. Pacjenci ze stwardnieniem rozsianym mają również anomalie naczyniowe. Chondrosarcoma to nowotwór złośliwy wywodzący się z komórek chrzęstnych. Jest to trzeci pod względem częstości występowania pierwotny nowotwór kości, po szpiczaku i kostniakomięsaku. Stanowi około 20% nowotworów kości i jest diagnozowany u około 600 pacjentów rocznie w Stanach Zjednoczonych. Do 40% chrzęstniakomięsaków powstaje z enchondromy. Ryzyko wystąpienia chrzęstniakomięsaka w OD wynosi do 45,8%, a w stwardnieniu rozsianym do 57,1%. Obecnie jedyną metodą leczenia pacjentów z tymi zaburzeniami jest leczenie chirurgiczne; nie ma skutecznej terapii farmakologicznej.

Zidentyfikowaliśmy heterozygotyczną utratę wariantów funkcji linii zarodkowej w PTPN11 (kodującym niereceptorową białkową fosfatazę tyrozynową SHP2) powodującą MC. We wstępnych badaniach zidentyfikowaliśmy także wariant PTPN11 R138X w naczyniaku śródbłoniaka siateczkowatego u pacjenta ze stwardnieniem rozsianym oraz wariant zarodkowy PTPN11 L560F u pacjenta z OD. PTPN11 koduje SHP2, cytozolową białkową fosfatazę tyrozynową zaangażowaną we wczesnym etapie sygnalizacji RAS/MAPK poniżej kilku receptorowych kinaz tyrozynowych, w tym EGFR i FGFR. Za pomocą analizy immunoblot zmierzyliśmy ekspresję produktów końcowych tego szlaku, pERK1 i 2, w fibroblastach od pacjentów z MC i OD i zaobserwowaliśmy zmniejszoną ekspresję pERK1 i 2 u pacjentów w porównaniu z grupą kontrolną (Sobreira i wsp., niepublikowane). Podobnie eksperymenty na mysich modelach z warunkowym nokautem Ptpn11 wykazały zmniejszoną sygnalizację ERK1/2 w chondrocytach pozbawionych SHP2. Podsumowując, wyniki te sugerują, że zmniejszenie sygnalizacji RAS/MAPK może prowadzić do powstawania enchondrom. Heterozygotyczne warianty somatyczne IDH1 i 2 zidentyfikowano w nowotworach części pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i OD. Żaden z wariantów nie został zidentyfikowany w DNA linii zarodkowej osób dotkniętych chorobą. Nasze wstępne badania zidentyfikowały warianty linii zarodkowej KDM4C i HIF1A, 2 geny, o których wiadomo, że oddziałują z IDH1 i 2, jako geny kandydujące u 2 niepowiązanych probantów z wieloma enchondromami.

Na podstawie tych wyników postawiliśmy hipotezę, że OD i stwardnienie rozsiane są zespołami predyspozycji do nowotworów powodowanymi przez warianty linii zarodkowej, takie jak nerwiakowłókniakowatość typu 1 i schwannomatoza. Kolejne trafienia w te same lub różne geny, takie jak IDH1 i IDH2 lub inne jeszcze zidentyfikowane geny, są zaangażowane w powstawanie enchondrom i chrzęstniakomięsaków. Co więcej, warianty te prawdopodobnie regulują w dół szlak RAS/MAPK lub znajdują się w genach, które oddziałują z IDH1 i 2.

Aby przetestować ten model, będziemy realizować następujące cele szczegółowe:

Cel szczegółowy 1. Kompleksowe zdefiniowanie cech fenotypowych pacjentów z OD i stwardnieniem rozsianym.

Hipoteza: OD i stwardnienie rozsiane to odrębne, niedostatecznie scharakteryzowane zespoły podatności na nowotwory o różnorodnych cechach. Niedawno zaproponowaliśmy wytyczne dotyczące diagnostyki i nadzoru dotyczące systematycznej oceny pacjentów z OD i MS9. Tutaj: (a) zidentyfikujemy pełny zestaw cech fenotypowych charakterystycznych dla pacjentów z OD i stwardnieniem rozsianym, dokonując szczegółowej oceny ich historii klinicznej i rodzinnej oraz cech fizycznych w NIH/CC; (b) określić liczbę, wielkość i lokalizację enchondrom i anomalii naczyniowych oraz zidentyfikować inne nowotwory u tych pacjentów, wykonując MRI lub prześwietlenie całego ciała, MRA i spektroskopię rezonansu magnetycznego mózgu; oraz (c) utworzył biobank próbek od pacjentów i członków rodziny do badań genetycznych, metabolicznych i funkcjonalnych.

Cel szczegółowy 2. Poszukiwanie brakujących wariantów sprawczych linii zarodkowej (i/lub mozaiki somatycznej) (kodujących i niekodujących) w DNA krwi, enchondrom, chrzęstniakomięsakom i powiązanym naczyniakom krwionośnym. Przeprowadzimy WGS na DNA linii zarodkowej i nowotworu (enchondroma, chrzęstniakomięsaki i naczyniaki krwionośne), aby zidentyfikować warianty linii zarodkowej we krwi i kolejne trafienia zaangażowane w powstawanie nowotworu. Przeprowadzimy również sekwencjonowanie RNA (RNAseq) na RNA wyizolowanym z próbek nowotworu, aby przeprowadzić analizę ekspresji genów i zidentyfikować inne możliwe szlaki dotknięte tymi zaburzeniami; oraz pomoc w interpretacji wariantów wykrytych przez WGS, zwłaszcza wariantów synonimicznych i niekodujących wpływających odpowiednio na splicing i liczebność RNA.

Cel szczegółowy 3. Aby przetestować hipotezę, że analiza standardowa może przeoczyć wariant przyczynowy ze względu na alternatywny sposób dziedziczenia, zastosujemy nowatorskie podejścia analityczne, które badają alternatywne sposoby dziedziczenia zwykle nie brane pod uwagę. Zbadamy sposoby dziedziczenia ojcowskiego i matczynego imprintingu oraz zbadamy warianty zidentyfikowane w genach, które unikają inaktywacji X. Dzięki WGS będziemy również mogli badać warianty genów połączonych z X, które unikają inaktywacji X, oraz warianty genów połączonych z Y.

Cel szczegółowy 4. Określenie wpływu przyczynowych wariantów OD lub stwardnienia rozsianego na szlaku HIF-1.

Hipoteza: Przyczynowe warianty OD i MS powodują obniżenie poziomu HIF1A i jego genów docelowych. Nasza wstępna analiza danych RNAseq z próbek fibroblastów i enchondrom od pacjentów z OD i stwardnieniem rozsianym wykazała upośledzoną indukcję genów związanych z HIF-1 w przeciwieństwie do innych nowotworów. Warianty HIF1A nie zostały zidentyfikowane jako powodujące chorobę, ale siedmiu naszych pacjentów ma wariant sprawczy tego genu. Stwierdziliśmy, że mutacje HIF1A i VHL występowały częściej u pacjentów z OD i stwardnieniem rozsianym w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05). Dlatego: (a) wykorzystamy modele oparte na komórkach typu knock-in, aby zbadać wpływ wariantów przyczynowych, które zidentyfikowaliśmy w HIF1A (zmutowany u siedmiu pacjentów), VHL (zmutowany u sześciu pacjentów) i KDM4C (zmutowany u czterech pacjentów ) na aktywność transkrypcyjną HIF-1 przy użyciu testu z podwójną lucyferazą40; oraz (b) zidentyfikować geny ulegające różnej ekspresji i zakłócone szlaki za pomocą enchondromy RNAseq.

Cel szczegółowy 5. Udostępnianie danych. Podobnie jak to robimy w innych projektach, prześlemy nasze dane sekwencyjne do dbGaP, aby ułatwić udostępnianie danych. JHM IRB ustali, czy udostępnianie jest zgodne z polityką genomiczną NIH. Ponadto, aby zidentyfikować inne osoby za pomocą danych istotnych dla naszych potencjalnych wariantów i genów, użyjemy GeneMatcher i Matchmaker Exchange. Nasze dane będziemy także przekazywać do bazy ClinVar i COSMIC. Chętnie uczestniczymy w konsorcjum mającym na celu utworzenie zasobu danych Kids First oraz ogólnego zbioru danych genetycznych dotyczących nowotworów u dzieci w NCI Genomic Data Commons.