Scoprire i geni dietro i tumori della cartilagine e le anomalie vascolari utilizzando il sequenziamento genomico

Progettazione dello studio:

Lo studio recluterà e arruolerà fino a 100 pazienti con malattia di Ollier (OD) e sindrome di Maffucci (SM) nell'arco di cinque anni. Ciascun partecipante sarà visitato presso il NIH Clinical Center (CC) per una visita di studio ospedaliera di 5 giorni o più.

Durante tale visita, verranno eseguite le seguenti procedure: assorbimetria a raggi X a doppia energia (DXA), radiografia del corpo intero, angiografia con risonanza magnetica (MRA), tomografia a emissione di positroni (PET) di tutto il corpo, risonanza magnetica imaging (MRI) e spettroscopia di risonanza magnetica a voxel singolo del cervello. Dopo essere stati visitati al NIH CC dal team di studio, i partecipanti riceveranno un riepilogo di tutti i risultati dei test e delle consultazioni completati presso il NIH.

I membri della famiglia arruolati per il sequenziamento del genoma non saranno sottoposti ad alcuna valutazione clinica presso il NIH CC.

Il dottor Gordon supervisionerà l'attuazione dello studio presso il NIH. La Dott.ssa Marini è stata coinvolta nella richiesta di sovvenzione originale dell'NIH ed è andata in pensione, ma mantiene un incarico presso l'NIH come scienziata emerita/volontaria. Il Dr. Marini presterà servizio nel protocollo come consulente clinico senior e lavorerà presso il NIH CC. Non acconsentirà ai partecipanti ma sarà presente a molte delle visite di studio.

I membri del gruppo di studio JHU avranno il permesso di lavorare e/o osservare presso il NIH; tuttavia non saranno considerati parte del gruppo di studio NIH e non saranno identificati come ricercatori associati NIH.

Obiettivi:

La malattia di Ollier (OD) e la sindrome di Maffucci (MS) sono caratterizzate da encondromi multipli che provocano gravi deformità scheletriche durante la prima infanzia e un aumento del rischio di hondrosarcomi e altre neoplasie. I pazienti con SM presentano anche anomalie vascolari. Il condrosarcoma è un tumore maligno che origina dalle cellule cartilaginee. È il terzo tumore maligno primario dell’osso più comune dopo il mieloma e l’osteosarcoma. Rappresenta circa il 20% dei tumori ossei e viene diagnosticato in circa 600 pazienti ogni anno negli Stati Uniti. Fino al 40% dei condrosarcomi derivano da un encondroma. Il rischio di condrosarcoma nell'OD arriva fino al 45,8% e nella SM fino al 57,1%. Attualmente l’unico trattamento per i pazienti affetti da questi disturbi è chirurgico; non esiste una terapia farmacologica efficace.

Abbiamo identificato varianti eterozigoti di perdita di funzione della linea germinale in PTPN11 (che codifica per una proteina non recettoriale tirosina fosfatasi SHP2) che causano MC. Negli studi preliminari, abbiamo anche identificato la variante PTPN11 R138X in un emangioendotelioma retiforme di un paziente con SM e la variante germinale PTPN11 L560F in un paziente con OD. PTPN11 codifica SHP2, una proteina citosolica tirosina fosfatasi coinvolta in una fase iniziale della segnalazione RAS/MAPK a valle di diversi recettori tirosin chinasi tra cui EGFR e FGFR. Utilizzando l'analisi immunoblot abbiamo misurato l'espressione dei prodotti finali di questo percorso, pERK1 e 2 nei fibroblasti di pazienti con MC e OD e abbiamo osservato una diminuzione dell'espressione di pERK1 e 2 nei pazienti rispetto ai controlli (Sobreira et al., non pubblicato). Allo stesso modo, esperimenti nei modelli murini knockout condizionali Ptpn11 hanno mostrato una ridotta segnalazione ERK1/2 nei condrociti privi di SHP2. Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che la riduzione del segnale RAS/MAPK può portare alla formazione di encondromi. Varianti somatiche eterozigoti di IDH1 e 2 sono state identificate nei tumori di una frazione dei pazienti con SM e OD. Nessuna delle due varianti è stata identificata nel DNA germinale degli individui affetti. E i nostri studi preliminari hanno identificato le varianti germinali KDM4C e HIF1A, 2 geni noti per interagire con IDH1 e 2, come geni candidati in 2 probandi non imparentati con encondromi multipli.

Sulla base di questi risultati, ipotizziamo che OD e MS siano sindromi di predisposizione al tumore causate da varianti germinali come la neurofibromatosi di tipo 1 e la schwannomatosi. Successivi colpi nello stesso o in geni diversi come IDH1 e IDH2 o altri geni ancora identificati sono coinvolti nella formazione di encondromi e condrosarcomi. Inoltre, queste varianti probabilmente sottoregolano la via RAS/MAPK o si trovano in geni che interagiscono con IDH1 e 2.

Per testare questo modello, perseguiremo i seguenti obiettivi specifici:

Obiettivo specifico 1. Definire in modo completo le caratteristiche fenotipiche dei pazienti con OD e SM.

Ipotesi: OD e MS sono sindromi distinte di suscettibilità al cancro sottocaratterizzate con caratteristiche diverse. Recentemente abbiamo proposto linee guida diagnostiche e di sorveglianza per la valutazione sistematica dei pazienti con OD e MS9. Qui: (a) identificheremo l'insieme completo delle caratteristiche fenotipiche caratteristiche dei pazienti con OD e SM eseguendo una valutazione dettagliata delle loro storie cliniche e familiari e delle caratteristiche fisiche presso il NIH/CC; (b) determinare il numero, le dimensioni e la posizione degli encondromi e delle anomalie vascolari e identificare altri tumori in questi pazienti eseguendo MRI o raggi X, MRA e spettroscopia di risonanza magnetica cerebrale dell'intero corpo; e (c) istituire una biobanca di campioni di pazienti e familiari per test genetici, metabolici e funzionali.

Obiettivo specifico 2. Ricerca di varianti causative mancanti della linea germinale (e/o del mosaico somatico) (codificanti e non codificanti) nel DNA di sangue, encondromi, condrosarcomi ed emangiomi associati. Effettueremo il WGS sul DNA della linea germinale e tumorale (encondroma, condrosarcomi ed emangiomi) per identificare le varianti della linea germinale nel sangue e i successivi risultati coinvolti nella formazione del tumore. Effettueremo anche il sequenziamento dell'RNA (RNAseq) sull'RNA isolato da campioni tumorali per eseguire un'analisi dell'espressione genica e identificare altri possibili percorsi interessati in questi disturbi; e per facilitare l'interpretazione delle varianti rilevate da WGS, in particolare varianti sinonime e non codificanti che influenzano rispettivamente lo splicing e l'abbondanza di RNA.

Obiettivo specifico 3. Per verificare l'ipotesi che l'analisi standard possa trascurare una variante causale a causa di una modalità di ereditarietà alternativa, applicheremo nuovi approcci analitici che indagano modalità alternative di ereditarietà tipicamente non considerate. Investigheremo le modalità di ereditarietà dell'imprinting paterno e materno e studieremo le varianti identificate nei geni che sfuggono all'inattivazione dell'X. Con WGS saremo anche in grado di studiare le varianti nei geni legati all'X che sfuggono all'inattivazione dell'X e le varianti nei geni legati all'Y.

Obiettivo specifico 4. Determinare l'effetto delle varianti causative di OD o MS nella via HIF-1.

Ipotesi: le varianti causative di OD e MS causano la downregulation di HIF1A e dei suoi geni bersaglio. La nostra analisi preliminare dei dati RNAseq provenienti da campioni di fibroblasti ed encondroma di pazienti con OD e SM ha mostrato una ridotta induzione di geni correlati a HIF-1 in contrasto con altri contesti tumorali. Le varianti HIF1A non sono state identificate come causa di malattia, ma sette dei nostri pazienti hanno una variante causativa in questo gene. Abbiamo scoperto che HIF1A e VHL erano mutati a un tasso più elevato tra i pazienti con OD e SM rispetto ai controlli (p <0,05). Pertanto: (a) utilizzeremo modelli cellulari knock-in per studiare l'effetto delle varianti causative identificate in HIF1A (mutato in sette pazienti), VHL (mutato in sei pazienti) e KDM4C (mutato in quattro pazienti ) sull'attività trascrizionale dell'HIF-1 utilizzando un test a doppia luciferasi40; e (b) identificare geni espressi in modo differenziale e percorsi interrotti con l'encondroma RNAseq.

Obiettivo specifico 5. Condivisione dei dati. Come stiamo facendo in altri progetti, invieremo i nostri dati di sequenza a dbGaP per facilitare la condivisione dei dati. Il JHM IRB determinerà che la condivisione è coerente con la politica genomica del NIH. Inoltre, per identificarne altri con dati rilevanti per le nostre varianti e geni candidati, utilizzeremo GeneMatcher e Matchmaker Exchange. Inoltre invieremo i nostri dati al database ClinVar e COSMIC. Siamo ansiosi di partecipare a un consorzio per istituire la Kids First Data Resource e il set di dati genetici complessivi per i tumori infantili presso l’NCI Genomic Data Commons.