Metotreksaatin aiheuttaman maha-suolikanavan intoleranssin ymmärtäminen juveniilisessa idiopaattisessa niveltulehduksessa ja lasten leukemiassa

Tausta:

Lapsuuden leukemia (Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL) on yleisin pahanlaatuinen syöpä lapsiväestössä (1). Eloonjäämisluvut ovat nousseet yli 85 prosenttiin kemoterapian edistymisen ansiosta. Suuriannoksinen metotreksaatti (MTX) on ALL-taudin (2–4) hoidon perustekijä. Ruoansulatuskanavan toksisuus on hyvin tunnettu haaste, joka liittyy suuriannoksiseen MTX-hoitoon (5). Tätä ei kuitenkaan kuvata merkittäväksi ongelmaksi näiden lasten keskuudessa, kun he saavuttavat ylläpitohoidon ja saavat pieniannoksista MTX-hoitoa. Lapset, joilla on juveniili idiopaattinen niveltulehdus (JIA), saavat myös pieniannoksista MTX-hoitoa. Näiden potilaiden joukossa MTX:n aiheuttama maha-suolikanavan intoleranssi on merkittävä ongelma. Tutkimukset ovat osoittaneet, että yli puolella JIA-potilaista on ongelmia MTX:n sietämisessä pahoinvoinnin vuoksi, mikä voi johtaa hoidon lopettamiseen (6,7). On suurelta osin tuntematonta, miksi MTX aiheuttaa pahoinvointia, mutta sekä farmakogeneettisten että psykologisten tekijöiden uskotaan vaikuttavan asiaan (8).

JIA on yleisin lasten krooninen reumaattinen sairaus. Ilman hoitoa sairaus aiheuttaa merkittävän lyhyt- ja pitkäaikaisen vamman ja elämänlaadun heikkenemisen. Ennuste on parantunut huomattavasti viime vuosina sairauden hallinnan huomattavan edistymisen seurauksena, ja MTX on JIA:n hoidon tukipilari (9-13).

Tämän projektin tavoitteena on lisätä ymmärrystä MTX:n aiheuttamasta maha-suolikanavan intoleranssista leukemiaa sairastavien ja JIA-potilaiden keskuudessa. Hankkeessa keskitytään pahoinvointiin ja tutkitaan pahoinvoinnin tasoa kahdessa potilasryhmässä ja verrataan, onko eroja. Tutkijat selvittävät edelleen farmakogeneettisiä ja psykologisia tekijöitä ja niiden suhdetta potilaan pahoinvointitasoon.

Farmakogeneettinen tausta:

MTX imeytyy maha-suolikanavasta ja kuljetetaan verenkiertoon enterosyyttien kuljettajaproteiinien avulla. MTX eliminoituu ensisijaisesti munuaisten kautta, mutta osa MTX:stä kulkee ensin enterohepaattisen verenkierron kautta (14,15). Tutkimukset suuriannoksisen MTX-hoidon käytöstä ALL-potilailla viittaavat siihen, että MTX:n nopea maksapuhdistuma lisää ruoansulatuskanavan toksisuuden astetta. Lisäksi on osoitettu, että potilailla, joilla on mutaatioita (Single Nucleotide Peptides, SNP) maksan kuljettajaproteiinia SLCO1B1 koodaavassa geenissä, joka vastaa MTX:n kuljettamisesta maksaan, on vähemmän maha-suolikanavan toksisuutta suuriannoksiselle MTX:lle (16). SLC19A1:n koodaama kuljettajaproteiini sijoitetaan sekä maksaan että enterosyytteihin (15).

Tutkimukset aikuisilla potilailla, joilla on diagnosoitu joko psoriaasi tai nivelreuma ja joita hoidettiin pieniannoksisella MTX-annoksella, ja tutkimukset ALL-potilailla suuriannoksisella MTX:llä osoittavat, että SLC19A1 liittyy MTX:n pitoisuuteen plasmassa ja punasoluissa sekä MTX:ään liittyvään toksisuuteen. (1,17-20). Kuljettajaproteiineja, jotka kuljettavat MTX:ää ulos maksasta ja sappitiehyisiin, koodaavat ABCC2 ja ABCB1(15). Tutkimukset aikuisilla nivelreumapotilailla pieniannoksisella MTX-annoksella, kroonista myelooista leukemiaa sairastavilla aikuisilla ja ALL-potilailla suuren annoksen MTX-potilailla ovat osoittaneet, että molemmat geenit ovat farmakokineettisesti tärkeitä ja ABCC2:n on lisäksi osoitettu liittyvän MTX:ään liittyvään maha-suolikanavan toksisuuteen ( 5,21-24). Aiemmat tutkimukset potilailla, joilla on nivelreuma, lasten leukemia ja JIA, ovat osoittaneet, että kliinisesti merkittävien SNP:iden esiintyvyys geeneissä, jotka koodaavat MTX:ään liittyviä kuljettajaproteiineja, ovat: SLCO1B1 (70,3 %), ABCB1 (20,6 %), ABCC2 (56,8 %), SLC19A1 (31 %) (5,16,17,19,21,25-28). Siksi tutkijat uskovat, että on mahdollista löytää valitut geneettiset polymorfismit MTX:ään liittyville kuljettajaproteiineille osallistuvasta tutkimuspopulaatiosta.

Farmakogeneettiset tavoitteet:

Tutki, liittyykö MTX:ään liittyvä maha-suolikanavan intoleranssi enterohepaattiseen verenkiertoon. Erityisesti sen määrittämiseksi, liittyvätkö SNP:t geeneissä, jotka koodaavat MTX:ään liittyviä maksan kuljettajaproteiineja, lääkkeen aiheuttamien maha-suolikanavan sivuvaikutusten tasoon.

Farmakogeneettiset hypoteesit:

Potilailla, joilla on SNP:itä geeneissä, jotka koodaavat MTX:ään liittyviä kuljettajaproteiineja maksassa, MTX:n enterohepaattinen verenkierto on alhaisempi ja heillä on siten vähemmän pahoinvointia kuin muilla potilailla.

Psykologinen tausta:

Aikuisilla syöpäpotilailla tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että kemoterapiahoidon jälkeen ilmenevä psykologinen pahoinvointi on mahdollinen selitys pahoinvuudelle, joka ei ole oikeassa suhteessa lääkkeen oksentelua aiheuttavaan potentiaaliin. Se on myös mahdollinen selitys syöpäpotilaiden pahoinvoinnin suurelle vaihtelulle samantyyppisen kemoterapian jälkeen (29,30). Eri syöpien kemoterapiaa saavilla lapsilla tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että psykologiset tekijät, kuten selviytymisstrategiat ja ahdistus, vaikuttavat kemoterapiaan liittyvään pahoinvointiin ja oksenteluun (31-33). Tutkijat haluavat selvittää, koskeeko tämä myös leukemiaa sairastavia lapsia ylläpitohoidossa pieniannoksisella MTX-hoidolla sekä JIA-potilaita pieniannoksisessa MTX-hoidossa.

Psykologiset tavoitteet:

Selvittää, liittyvätkö tutkimuspopulaation pahoinvoinnin selviytymisstrategiat ja ahdistustaso MTX:n aiheuttaman maha-suolikanavan intoleranssin asteeseen. Ja tutki, onko näiden kahden potilasryhmän välillä eroa.

Psykologiset hypoteesit:

Riittämättömät psykologiset selviytymisstrategiat ja korkea ahdistuneisuus voivat aiheuttaa psyykkisesti perustuvaa pahoinvointia. Siten potilailla, joilla on korkea ahdistustaso ja riittämättömät selviytymisstrategiat, on suurempi pahoinvointiaste MTX-hoidossa kuin muilla potilailla.

Näkökulmat Tämä projekti auttaa ymmärtämään paremmin MTX:n aiheuttamaa intoleranssia lapsilla, joilla on leukemia ja JIA. Tästä on hyötyä myös kaikille muille lapsille, jotka saavat pieniannoksista MTX-hoitoa. Hankkeessa optimoidaan lasten leukemian ylläpitohoitoa ja JIA:n hoitoa käyttämällä potilaiden SNP-genotyyppejä määrittämään, kuka sietää MTX:ää ja kuka ei. Lisäksi tunnistaa potilaat, joilla psykologinen interventio voi vähentää MTX:n aiheuttamaa pahoinvointia.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuspopulaatio koostuu:

1. Lapset, joilla on diagnosoitu ALL ylläpitohoidossa
2. Lapset, joilla on diagnosoitu JIA ILAR-kriteerien mukaan

Katso sisällyttämis-/poissulkemiskriteerit kohdasta "Kelpoisuusehdot". Jokaiselle potilaalle merkitään luettelo sairauskohtaisista ominaisuuksista. MTX:n aiheuttaman intoleranssin taso määritetään sähköisellä "pahoinvointipäiväkirjalla" neljän viikon ajan, joka sisältää "pahoinvoinnin kasvot" perustuen "kivun kasvojen asteikkoon" (34). Ruoansulatuskanavan sivuvaikutuksia arvioidaan edelleen Metotreksaatti-intoleranssi-vakavuuspistekyselylomakkeella (MISS) (35).

Farmakogeneettiset menetelmät:

Jokaisesta potilaasta otettuja verinäytteitä käytetään määrittämään SNP:iden esiintyvyys geeneissä, jotka koodaavat MTX:ään liittyviä kuljettajaproteiineja (geenit mukaan lukien: SLCO1B1, SLC19A1, ABCC2, ABCB1). Geneettinen analyysi tehdään Århusin yliopiston Biolääketieteen instituutissa. Genotyypitys suoritetaan käyttämällä Sequenom MassARRAY Genotyping -järjestelmää (Sequenom, San Diego, CA). Lyhyesti sanottuna multipleksi-PCR suoritetaan 5 µl:n reaktioissa, jotka sisältävät 10 ng genomista DNA:ta, 1,25 x PCR-puskuria, 0,5 mM dNTP:tä, 100 nM kutakin aluketta ja 0,5 U Taq-polymeraasia käyttäen normaaleja sykliolosuhteita. Sitten PCR-tuotteet käsitellään SAP:lla ja koetinpidennysreaktio (iPLEX) suoritetaan iPLEX-standardin protokollan (Sequenom) mukaisesti. Näytteet, joista on poistettu suola, analysoidaan käyttämällä Bruker-matriisiavusteista laserdesorptio/ionisaatio-lentoaika (MALDI-TOF) massaspektrometriä (Sequenom) ja genotyypit määritetään käyttämällä MassARRAY Typer 3.4 -ohjelmistoa (Sequenom). Verinäytettä käytetään myös MTX-polyglutamaattien pitoisuuden mittaamiseen erytrosyyteissä (Ery-MTX-PG). Ery-MTX-PG:n mittaus suoritetaan HPLC-tekniikalla lasten onkologian laboratoriossa Rigshospitaletissa, Kööpenhaminassa, Tanskassa.

2) Psykologiset menetelmät: Potilaiden selviytymisstrategioita tutkitaan pahoinvointi-selviytymiskyselylomakkeella, joka on kehitetty erityisesti lapsille kehitetyllä ja aiemmin tanskaksi käännettynä, validoituna ja aiemmissa tutkimuksissa käytettynä. Se koostuu kahdeksasta tärkeimmistä selviytymisstrategioista: tiedonhaku, ongelmanratkaisu, sosiaalisen tuen etsiminen, positiiviset itseilmaisut, käyttäytymisen häiriötekijä, kognitiivinen häiriötekijä, ulkoistaminen ja sisäistäminen/katastrofiointi (36,37,39,40). Potilaiden ahdistuneisuustaso arvioidaan "Beck Youth Inventories" (BYI) -tutkimuksella, joka on aiemmin käännetty tanskaksi ja validoitu. BYI on lyhyt ja helppokäyttöinen. Se koostuu 20 lauseesta, jotka tutkivat pelkoa, huolestuttavia ja ahdistukseen liittyviä fysiologisia oireita (38).

Tilastot Teholaskenta: Tämä perustuu ensisijaiseen tavoitemittaan (pahoinvoinnin aste), joka on kvantifioitu pahoinvointipäiväkirjan "pahoinvointiasteikolla". Asteikolla on loppupisteet: "ei pahoinvointia" ja "äärimmäinen pahoinvointi", numeroina 0-5. Tulokset aikaisemmasta tutkimuksesta, jossa käytettiin kipuasteikon kasvoja, osoittavat, että keskiarvopisteet olivat 0,74 (SD=0,70) ja 0,91 (SD=0,86) (36). Kliinisen arvioinnin perusteella tutkijat odottavat, että JIA-potilaiden ryhmän keskimääräinen pahoinvointipistemäärä on 2,5 ja 1 ALL-potilailla. Keskihajonnan odotetaan olevan samanlainen kuin yllä olevassa tutkimuksessa (SD=0,9). Jos merkitsevyystaso (alfa) on 0,05, teho on 80 % ja ryhmäkokojen välinen suhde on 2, niin tutkimuspopulaation laskennallinen koko on JIA-ryhmässä 10 potilasta ja ALL-ryhmässä 5 potilasta. Jos vain pahoinvoinnin keskimääräinen pistemäärä on 2 JIA-potilaiden ryhmässä, mutta silti 1 ALL-potilaiden ryhmässä ja keskihajonta on odotettua suurempi, SD = 2. Mutta alfa on silti 0,05, teho on 80%, ja ryhmien kokojen suhde on edelleen 2. Tällöin tutkimuspopulaation laskennallinen koko on 96 potilasta JIA-ryhmässä ja 48 ALL-ryhmässä.

Tutkimussuunnitelma

Tutkimusryhmä koostuu:

Århusin yliopistollisen sairaalan Skejbyn pediatrian osastolta:

Päähakija: Nini Kyvsgaard Brix Nørgaard, PhD-opiskelija (kirjoitettu Århusin yliopistoon), M.D.

Pääohjaaja: Troels Herlin, professori, DMSc; Ohjaaja: Torben Stamm Mikkelsen, MD, PhD.

Århusin yliopiston biolääketieteen instituutista:

Ohjaaja: Thomas Juhl Corydon, apulaisprofessori, PhD, Århusin yliopiston biolääketieteen instituutin apulaisjohtaja.

Århusin yliopiston psykologian instituutista:

Ohjaaja: Mikael Thastum, professori, PhD, kliinisen psykologian johtaja, Århusin yliopisto.

Tohtoriopiskelija suorittaa ja koordinoi projektin päivittäistä toteutusta ohjaajaryhmän ohjauksessa. Hankkeen ensimmäinen ja toinen vuosi on omistettu potilastietojen ja verinäytteiden keräämiselle. Ensinnäkin JIA-potilaiden sisällyttäminen aloitetaan. Sitten otetaan KAIKKI potilaat mukaan. Kolmas vuosi on omistettu geenipolymorfismien ja MTX-tasojen analysoinnille, data-analyysille ja käsikirjoitusten kokoamiselle julkaisua varten. Tutkimusryhmällä on laaja tutkimuskokemus ja kliininen asiantuntemus tällä alalla.

Toteutettavuus Laboratoriotilat verinäytteiden ottamista ja niiden alkukäsittelyä varten ovat käytettävissä. Lopullinen analyysi suoritetaan kohdassa "farmakogeneettiset menetelmät" määritellyllä tavalla. Tutkijoilla on käytössään ohjelmisto, jolla kyselyt voidaan suorittaa sähköisesti, sekä tilastollinen tuki.