Mikrobiomitesti paksusuolensyövän seulomiseksi (NI-GUILTI)

Kolorektaalisyöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti. Vuonna 2020 uusia tapauksia on lähes 2 miljoonaa ja kuolemantapauksia miljoona. Viime vuosikymmeninä väestöpohjaiset seulontaohjelmat keskimääräisen riskin väestölle ovat vakiintuneet tehokkaaksi strategiaksi CRC:n ilmaantuvuuden ja kuolleisuuden vähentämiseksi syövän varhaisen havaitsemisen avulla. Ulosteen immunokemiallinen testaus (FIT), joka on vertailudiagnostiikkatyökalu useimmissa maissa, on edelleen alle optimaalisen diagnostisen tuoton, sekä adenoomat jääneet väliin että pääasiassa tarpeettomia kolonoskopioita. Näistä syistä viime vuosina uusien, ei-invasiivisten biomarkkerien tunnistaminen on ehdottomasti kannattanut CRC:tä. Suuri joukko todisteita osoittaa, että suoliston mikrobiomin muutokset ja tiettyjen taksonien rikastuminen (esim. Fusobacterium nucleatum, Parvimonas micra ja muut) ovat mukana CRC:n patogeneesissä. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset, mukaan lukien ryhmämme metagenomiset meta-analyysit, ovat löytäneet yhteisiä mikrobien allekirjoituksia, jotka pystyvät toistettavasti erottamaan CRC-potilaat ja terveet kontrollit. Tämän näytön perusteella kansainväliset ohjeet ovat äskettäin puoltaneet mikrobiomipohjaisten biomarkkerien hyödyntämistä CRC:n seulonnassa kliinisessä käytännössä, mutta tällaisia ​​tutkimuksia ei ole vielä saatavilla.

Ensisijaisena tavoitteena on kehittää suoliston mikrobiomipohjainen diagnostinen työkalu CRC:n ja pitkälle edenneiden kolorektaalisten adenoomien tunnistamiseen.

Toissijaiset tavoitteet ovat:

• Yhdistää FIT kliinisiin ja kolonoskopian tuloksiin
• Ilmoittautuneiden potilaiden suoliston mikrobiomin karakterisointi
• Mikrobiomin allekirjoitusten yhdistäminen kliinisiin ja kolonoskopian tuloksiin

Tämä on havainnollinen prospektiivinen monikeskustutkimus, jossa potilaat valitaan kansalliseen paksusuolensyövän (CRC) seulontaohjelmaan osallistuvien joukosta ja niiden joukosta, jotka viittaavat kaikkiin tähän tutkimukseen osallistuviin keskuksiin kolonoskopiaa varten.

Tässä tutkimuksessa otetaan huomioon potilaat, joilla on kaikki sisällyttämiskriteerit eikä yksikään poissulkemiskriteeri (tämän verkkosivuston erityisessä osiossa). Yhteensä n = 1006 tutkittavaa otetaan mukaan. Tarkemmin ottaen 838 potilasta otetaan mukaan otoskoon laskennan perusteella ja kattaakseen 10 %:n keskeyttämisriskin. Lisäksi 168 potilaan lisäkohortti (20 % kokonaismäärästä) rekisteröidään käytettäväksi sisäisenä validointisarjana tunnistettujen biomarkkerien tiukkaa validointia varten (validointikohortti). Tähän validointiryhmään kuuluvilla potilailla on samat poissulkemis- ja sisällyttämiskriteerit kuin muilla potilailla, ja he käyvät läpi samat tutkimusmenettelyt.

Lähtötilanteessa kaikki ilmoittautuneet potilaat toimittavat ulostenäytteen (kerätty käyttämällä puskuria genomin säilyttämistä varten) 2 viikon sisällä ilmoittautumisesta, ja niitä säilytetään -80 °C:ssa kussakin kliinisessä keskuksessa ja niille osoitetaan tunnistamattomat tunnisteet.

Lisäksi tallennetaan demografiset, kliiniset ominaisuudet ja laboratoriotiedot.

Kaikista ilmoittautuneista potilaista kliinikot tallentavat seuraavat tiedot:

-CRC:n tuttu historia; -Lisäsairaudet; - Huumeiden saanti; - Ruoansulatuskanavan (GI) ja hälytysoireet (raudanpuuteanemia, hematokesia, selittämätön painonpudotus, vatsakipu, äkillinen muutos suolistotottumuksissa); - Ruokavaliotavat; -Tupakointi ja alkoholin käyttö; -BMI; -Kvantitatiiviset FIT-tiedot; -Tiedot aiemmista FIT- ja/tai kolonoskopioista ja/tai virtuaalisista kolonoskopioista

Kaikille ilmoittautuneille potilaille tehdään kolonoskopia 4 viikon kuluessa positiivisesta FIT:stä, kolonoskopian jälkeen endoskooppiset ominaisuudet (koko, paikka, muoto perustuen Pariisin luokkaan.) ja havaittujen leesioiden histopatologiset ominaisuudet kerätään.

Pitkälle edenneet kolorektaaliset adenoomit määritellään adenoomiksi, jotka ovat suurempia tai yhtä suuria kuin 10 mm ja/tai joissa on yli 25 % tai yhtä suuria villoisia komponentteja, ja/tai korkea-asteen dysplasia.

Lisäksi CRC-diagnoosin saaneille potilaille tehdään myös koko kehon TT-skannaus taudin vaiheittaistamiseksi ja heidät ohjataan onkologiselle reitille kliinisessä käytännössä ja kerätään seuraavat tiedot: imusolmukkeiden etäpesäkkeiden ja elinten etäpesäkkeiden esiintyminen, TNM luokka.

Ilmoittautumisvaihe kestää 20 kuukautta.

Ilmoittautumisvaiheen lopussa tutkijat suorittavat mikrobiomianalyysin, ja tutkijat yhdistävät kliiniset, endoskooppiset ja mikrobitiedot tilastollisten ja koneoppimisalgoritmien avulla tunnistaakseen CRC:hen ja pitkälle edenneisiin kolorektaalisiin adenoomeihin liittyvät mikrobibiomarkkerit. pisteytysjärjestelmään perustuva diagnostinen työkalu. Analyyttinen vaihe kestää 4 kuukautta.

Tutkimustulokset on kuvattu tämän verkkosivuston erityisessä osiossa.

Mikrobiomianalyysi suoritetaan haulikkosekvensointitekniikoilla. Lisäksi saadakseen joukon mikrobilajeja, jotka liittyvät enimmäkseen CRC:hen ja kehittyneisiin kolorektaalisiin adenoomeihin, tutkijat hyödyntävät koneoppimissovelluksia esimerkiksi käyttämällä laajalti hyväksyttyjä Random Forest -algoritmeja sekä meta-analyyttisiä lähestymistapoja, jotka yhdistävät suuren kohorttimme aiemmin julkaistuihin metagenomiset kohortit. Määritelty ryhmä mikrobilajeja, jotka liittyvät enimmäkseen CRC:hen ja edistyneisiin kolorektaalisiin adenoomeihin, tarjoaa kattavan riskipisteen mikrobiomin ominaisuuksiin perustuvan kahdella erityisellä tavoitteella FIT-diagnostiikkatyökalun tarkkuuden parantamiseksi ja kliinikkojen helposti tulkittavaksi.

Kaikki kerätyt kliiniset tiedot yhdistetään tilastollisesti mikrobien ominaisuuksien luokitteluun eniten liittyvistä vähiten. Näitä luokituksia hyödynnetään arvioitaessa uuden yksilön mikrobiomiprofiilia ja raportoimaan, kuinka monta edellisessä paneelissa määritellyistä lajeista löytyy, ja siten ne liittyvät CRC:hen ja edistyneisiin kolorektaalisiin adenoomiin. Tunnistettujen lajien ja kiinnostavien tekijöiden välisiä assosiaatioita arvioidaan vankkojen tilastollisten analyysimenetelmien, kuten osittaisen korreloinnin tai lineaarisen mallinnuksen, avulla. Sitten assosiaatiot asetetaan paremmuusjärjestykseen ja niitä verrataan saman lajin merkkiaineiden välillä, jolloin kullekin lajille annetaan prioriteettipisteet. Erityistä huomiota kiinnitetään mahdollisten hämmentäviä merkkiaineita, joiden tiedetään liittyvän eroihin mikrobiomin koostumuksessa, esimerkiksi iässä, ja joita sen sijaan tulisi käyttää kovariaatteina tilastollisessa mallintamisessa. Tilastollisen mallintamisen lisäksi lajien ja merkkiaineiden välisiä assosiaatioita arvioidaan myös ML-lähestymistapojen avulla, erityisesti niillä, jotka antavat ominaisuuden tärkeyspisteet syöteominaisuuksille (tapauksessamme lajeille), joiden avulla lajit voidaan luokitella eri markkerien välillä ( esim. Random Forest, LASSO jne.).

Jatkuvat muuttujat raportoidaan keskimääräisenä ± keskihajonnana tai mediaani- ja kvartiilivälinä (IQR), ja kategorisista muuttujista on yhteenveto frekvenssinä ja prosentteina. Muuttujien vertailut tehdään t-testillä (tai Mann-Whitney/Kruskal-Wallis), Chi-neliötestillä tai Fisherin eksaktitestillä tapauksen mukaan. P-arvon <0,05 katsotaan osoittavan tilastollista merkitsevyyttä. Logistisia regressiomalleja suoritetaan tuloksiin riippumattomasti liittyvien muuttujien läsnäolon tunnistamiseksi. Malleissa huomioidut muuttujat valittiin vaiheittaisella mallivalinnalla ja kliinisen merkityksen ohjaamiseksi. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä SPSS v. 28.0 for Macintosh -ohjelmaa (SPSS Inc., Chicago, USA). Tutkijat käyttävät scikit-learn Python -pakettiin perustuvaa Machine Learning (ML) -kehystä käyttämällä ristiinvalidointia, jossa on 100 bootstrap-iteraatiota ja 80/20 satunnainen jakaminen harjoitus- ja testauslaskoksiin. Luokittelu- ja regressio-ML-algoritmeja koulutetaan sekä mikrobiomilajitason taksonomisten suhteellisten runsauksien että toiminnallisten potentiaalisten profiilien suhteen. Lajitason taksonominen runsaus arvioidaan MetaPhlAn 4:llä (käyttäen uusimpia saatavilla olevia tietokantoja, tällä hetkellä nimeltään Oct22) ja normalisoidaan käyttämällä arcsin-sqrt-muunnosta koostumustiedoille. Toiminnalliset potentiaaliprofiilit arvioidaan käyttämällä uusinta HUMANN 4 -versiota ja tutkijat huomioivat sekä yksittäisten mikrobigeeniperheiden että aineenvaihduntareittien runsausarviot. Lajien ja merkkiaineiden osittaiset korrelaatiot lasketaan käyttämällä Spearman-indeksiä poikkeavien arvojen aiheuttamien harhojen välttämiseksi ja korjataan yhteismuuttujilla, kuten sukupuoli, ikä ja painoindeksi, joiden tiedetään vaikuttavan mikrobiomin koostumukseen. Osittaiset korrelaatioarvot korjataan käyttämällä Benjamini-Hochberg-menettelyä väärien havaintojen määrään.