Badanie mikrobiomu w badaniach przesiewowych w kierunku raka jelita grubego (NI-GUILTI)

Rak jelita grubego (CRC) jest trzecim najczęstszym nowotworem i drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów na świecie, z prawie 2 milionami nowych przypadków i milionem zgonów w 2020 roku. W ostatnich dziesięcioleciach populacyjne programy badań przesiewowych dla populacji średniego ryzyka stały się skuteczną strategią zmniejszania zarówno częstości występowania, jak i śmiertelności na CRC poprzez wczesne wykrywanie raka. Badanie immunochemiczne kału (FIT), referencyjne narzędzie diagnostyczne w większości krajów, nadal zapewnia nieoptymalną skuteczność diagnostyczną, zarówno w przypadku pominiętych gruczolaków, jak i głównie niepotrzebnych kolonoskopii. Z tych powodów w ostatnich latach w dziedzinie CRC zdecydowanie zaleca się identyfikację nowych, nieinwazyjnych biomarkerów. Wiele dowodów wskazuje, że zmiany w mikrobiomie jelitowym i wzbogacenie określonych taksonów (np. Fusobacterium jądro, Parvimonas micra i inne) biorą udział w patogenezie CRC. Co więcej, ostatnie badania, w tym metaanalizy metagenomiczne przeprowadzone przez naszą grupę, odkryły wspólne sygnatury drobnoustrojów, które są w stanie w powtarzalny sposób rozróżnić pacjentów z CRC od zdrowych osób z grupy kontrolnej. W oparciu o te dowody międzynarodowe wytyczne zalecały ostatnio wykorzystanie biomarkerów opartych na mikrobiomie do badań przesiewowych CRC w praktyce klinicznej, ale takie badania nie są jeszcze dostępne.

Głównym celem jest opracowanie narzędzia diagnostycznego opartego na mikrobiomie jelitowym, umożliwiającego identyfikację CRC i zaawansowanych gruczolaków jelita grubego.

Cele drugorzędne to:

• Powiązanie FIT z wynikami klinicznymi i kolonoskopowymi
• Scharakteryzowanie mikrobiomu jelitowego włączonych pacjentów
• Powiązanie sygnatur mikrobiomów z wynikami klinicznymi i kolonoskopią

Jest to obserwacyjne, prospektywne, wieloośrodkowe badanie, w którym pacjenci zostaną wybrani spośród osób zapisanych do krajowego programu badań przesiewowych w kierunku raka jelita grubego (CRC) i spośród tych, którzy będą kierowani do wszystkich ośrodków biorących udział w tym badaniu w celu wykonania kolonoskopii przesiewowej.

Pacjenci spełniający wszystkie kryteria włączenia i żadne z kryteriów wykluczenia (szczegółowo opisanych w odpowiedniej sekcji tej witryny) zostaną wzięci pod uwagę w tym badaniu. Łącznie zapisanych zostanie n=1006 przedmiotów. Mówiąc dokładniej, 838 pacjentów zostanie włączonych na podstawie obliczeń wielkości próby i w celu pokrycia 10% ryzyka rezygnacji. Co więcej, do badania zostanie włączona dodatkowa kohorta 168 pacjentów (20% całości) w celu wykorzystania jej jako zestawu do wewnętrznej walidacji na potrzeby rygorystycznej walidacji zidentyfikowanych biomarkerów (kohorta walidacyjna). Pacjenci włączeni do tej kohorty walidacyjnej będą mieli takie same kryteria wykluczenia i włączenia jak inni pacjenci i zostaną poddani tym samym procedurom badania.

Na początku badania wszyscy włączeni pacjenci dostarczą próbkę kału (pobraną przy użyciu buforu do konserwacji genomu) w ciągu 2 tygodni od włączenia i będą przechowywane w temperaturze -80°C w każdym ośrodku klinicznym i otrzymają zanonimizowane identyfikatory.

Ponadto rejestrowane będą dane demograficzne, kliniczne i laboratoryjne.

W przypadku wszystkich włączonych pacjentów lekarze będą rejestrować następujące dane:

-Znana historia CRC; -Choroby współistniejące; -Przyjmowanie narkotyków; - Objawy ze strony przewodu pokarmowego i objawy alarmowe (niedokrwistość z niedoboru żelaza, hematochezja, niewyjaśniona utrata masy ciała, ból brzucha, nagła zmiana rytmu wypróżnień); -Nawyki żywieniowe; -Palenie i spożywanie alkoholu; -BMI; -Ilościowe dane FIT; -Informacje na temat poprzednich FIT i/lub kolonoskopii i/lub wirtualnych kolonoskopii

Wszyscy włączeni pacjenci zostaną poddani kolonoskopii w ciągu 4 tygodni od pozytywnego wyniku FIT, po kolonoskopii, po określeniu parametrów endoskopowych (rozmiar, umiejscowienie, kształt w oparciu o klasę paryską). i zebrana zostanie charakterystyka histopatologiczna wykrytych zmian.

Zaawansowane gruczolaki jelita grubego będą definiowane jako gruczolaki większe lub równe 10 mm i/lub z zawartością kosmków większą lub równą 25% i/lub dysplazją dużego stopnia.

Ponadto u pacjentów, u których zdiagnozowano CRC, zostanie wykonane również badanie TK całego ciała w celu ustalenia stopnia zaawansowania choroby oraz skierowani na ścieżkę onkologiczną w praktyce klinicznej, gdzie zostaną pobrane następujące dane: obecność przerzutów w węzłach chłonnych i przerzutach narządowych, klasa TNM.

Faza rekrutacyjna będzie trwała 20 miesięcy.

Na koniec fazy rekrutacji badacze przeprowadzą analizę mikrobiomu, a następnie połączą dane kliniczne, endoskopowe i mikrobiologiczne za pomocą algorytmów statystycznych i uczenia maszynowego, aby zidentyfikować specyficzne biomarkery drobnoustrojów powiązane z CRC i zaawansowanymi gruczolakami jelita grubego, aby opracować nowy narzędzie diagnostyczne, oparte na systemie scoringowym. Faza analityczna potrwa 4 miesiące.

Wyniki badania są szczegółowo opisane w odpowiedniej sekcji tej witryny internetowej.

Analiza mikrobiomu zostanie przeprowadzona przy użyciu technik sekwencjonowania typu shotgun. Co więcej, aby uzyskać panel gatunków drobnoustrojów związanych głównie z CRC i zaawansowanymi gruczolakami jelita grubego, badacze wykorzystają aplikacje do uczenia maszynowego, na przykład przy użyciu powszechnie przyjętych algorytmów Random Forest, a także podejścia metaanalityczne integrujące naszą dużą kohortę z wcześniej opublikowanymi kohorty metagenomiczne. Zdefiniowany panel gatunków drobnoustrojów związanych głównie z CRC i zaawansowanymi gruczolakami jelita grubego zapewni kompleksową ocenę ryzyka w oparciu o cechy mikrobiomu, z dwoma konkretnymi celami: poprawą dokładności testowania narzędzia diagnostycznego FIT i łatwością interpretacji przez klinicystów.

Wszystkie zebrane dane kliniczne zostaną statystycznie połączone w celu uszeregowania cech drobnoustrojów od najbardziej do najmniej powiązanych. Rankingi te zostaną wykorzystane do oceny profilu mikrobiomu nowego osobnika oraz do podania liczby znalezionych gatunków określonych w poprzednim panelu, a zatem powiązanych z CRC i zaawansowanymi gruczolakami jelita grubego. Powiązania między zidentyfikowanymi gatunkami i twórcami zainteresowania zostaną oszacowane za pomocą solidnych metod analizy statystycznej, takich jak częściowa korelacja lub modelowanie liniowe. Następnie powiązania zostaną uszeregowane i porównane pod względem markerów tego samego gatunku, dając każdemu gatunkowi punktację priorytetową. Szczególna uwaga zostanie poświęcona identyfikacji potencjalnych markerów zakłócających, o których wiadomo, że są powiązane z różnicami w składzie mikrobiomu, na przykład wiekiem, które zamiast tego powinny być stosowane jako współzmienne w modelowaniu statystycznym. Oprócz modelowania statystycznego, powiązania między gatunkami i markerami będą również oceniane za pomocą podejść ML, w szczególności tych zapewniających oceny ważności cech dla cech wejściowych (w naszym przypadku gatunku), które można wykorzystać do uszeregowania gatunku według różnych markerów ( np. Losowy las, LASSO itp.).

Zmienne ciągłe będą podawane jako średnia ± odchylenie standardowe lub jako mediana i rozstęp międzykwartylowy (IQR), a zmienne kategoryczne podsumowano jako częstotliwość i procent. Porównania zmiennych będą dokonywane za pomocą testu t (lub testu Manna-Whitneya/Kruskala-Wallisa), testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera, zależnie od potrzeb. Za wskazanie istotności statystycznej zostanie uznana wartość p <0,05. Zostaną wykonane modele regresji logistycznej w celu zidentyfikowania obecności zmiennych niezależnie powiązanych z wynikami. Zmienne uwzględnione w modelach wybrano w drodze etapowej selekcji modelu, kierując się znaczeniem klinicznym. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu SPSS v. 28.0 dla komputerów Macintosh (SPSS Inc., Chicago, USA). Badacze zastosują platformę uczenia maszynowego (ML) opartą na pakiecie Pythona scikit-learn, stosując podejście krzyżowej walidacji ze 100 iteracjami ładowania początkowego i losowym podziałem 80/20 na części szkoleniowe i testowe. Algorytmy klasyfikacji i regresji ML zostaną przeszkolone zarówno w zakresie względnej liczebności taksonomicznej na poziomie gatunku mikrobiomu, jak i profili potencjału funkcjonalnego. Liczebność taksonomiczna na poziomie gatunku zostanie oszacowana za pomocą MetaPhlAn 4 (przy użyciu najnowszych dostępnych baz danych, obecnie nazwanych 22 października) i znormalizowana przy użyciu transformacji arcsin-sqrt dla danych o składzie. Profile potencjału funkcjonalnego zostaną oszacowane przy użyciu najnowszej wersji HUMANN 4, a badacze rozważą zarówno szacunki liczebności rodzin pojedynczych genów drobnoustrojów, jak i szlaków metabolicznych. Częściowe korelacje między gatunkami i markerami zostaną obliczone przy użyciu indeksu Spearmana, aby uniknąć błędów systematycznych wynikających z wartości odstających, i skorygowane o współzmienne, takie jak płeć, wiek i wskaźnik masy ciała, o których wiadomo, że mają wpływ na skład mikrobiomu. Częściowe wartości korelacji zostaną skorygowane przy użyciu procedury Benjaminiego-Hochberga dla współczynnika fałszywych odkryć.