Mikrobiomtests zur Früherkennung von Darmkrebs (NI-GUILTI)

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Krebsart und die zweithäufigste Krebstodesursache weltweit, mit fast 2 Millionen Neuerkrankungen und einer Million Todesfällen im Jahr 2020. In den letzten Jahrzehnten haben sich bevölkerungsbasierte Screening-Programme für Populationen mit durchschnittlichem Risiko als wirksame Strategie etabliert, um sowohl die Inzidenz als auch die Mortalität von Darmkrebs durch die Früherkennung von Krebs zu reduzieren. Der fäkale immunchemische Test (FIT), das Referenzdiagnostikinstrument in den meisten Ländern, weist immer noch eine suboptimale diagnostische Ausbeute auf, da sowohl Adenome übersehen als auch vor allem unnötige Koloskopien durchgeführt werden. Aus diesen Gründen wird in den letzten Jahren die Identifizierung neuartiger, nicht-invasiver Biomarker im Bereich des Darmkrebses stark vorangetrieben. Zahlreiche Belege zeigen, dass Veränderungen des Darmmikrobioms und die Anreicherung bestimmter Taxa (z. B. Fusobacterium nucleatum, Parvimonas micra und andere) sind an der Pathogenese von Darmkrebs beteiligt. Darüber hinaus haben aktuelle Studien, einschließlich metagenomischer Metaanalysen unserer Gruppe, gemeinsame mikrobielle Signaturen entdeckt, die reproduzierbar zwischen Patienten mit Darmkrebs und gesunden Kontrollpersonen unterscheiden können. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben internationale Leitlinien kürzlich die Nutzung mikrobiombasierter Biomarker für das Screening von Darmkrebs in der klinischen Praxis befürwortet, derartige Studien liegen jedoch bislang noch nicht vor.

Das Hauptziel besteht darin, ein auf dem Darmmikrobiom basierendes Diagnosetool zur Identifizierung von Darmkrebs und fortgeschrittenen kolorektalen Adenomen zu entwickeln.

Die sekundären Ziele sind:

• Verknüpfung von FIT mit klinischen und Koloskopie-Ergebnissen
• Charakterisierung des Darmmikrobioms der eingeschlossenen Patienten
• Verknüpfung von Mikrobiomsignaturen mit klinischen und Koloskopie-Ergebnissen

Hierbei handelt es sich um eine beobachtende, prospektive, multizentrische Studie, bei der die Patienten unter denjenigen ausgewählt werden, die am nationalen Programm zur Früherkennung von Darmkrebs (CRC) teilnehmen, und unter denen, die sich zur Vorsorgekoloskopie an alle an dieser Studie beteiligten Zentren wenden.

Für diese Studie werden Patienten berücksichtigt, die alle Einschlusskriterien und keines der Ausschlusskriterien erfüllen (im Detail im entsprechenden Abschnitt dieser Website beschrieben). Insgesamt werden n=1006 Probanden eingeschrieben. Genauer gesagt werden 838 Patienten auf der Grundlage der Berechnung der Stichprobengröße und zur Abdeckung eines 10-prozentigen Abbruchrisikos aufgenommen. Darüber hinaus wird eine zusätzliche Kohorte von 168 Patienten (20 % der Gesamtzahl) aufgenommen, die als interner Validierungssatz für die strenge Validierung der identifizierten Biomarker verwendet wird (Validierungskohorte). Für Patienten, die in diese Validierungskohorte aufgenommen werden, gelten dieselben Ausschluss- und Einschlusskriterien wie für andere Patienten und sie durchlaufen dieselben Studienverfahren.

Zu Beginn stellen alle eingeschriebenen Patienten innerhalb von 2 Wochen nach der Einschreibung eine Stuhlprobe (gesammelt unter Verwendung eines Puffers zur Genomkonservierung) zur Verfügung und werden in jedem klinischen Zentrum bei -80 °C gelagert und mit nicht identifizierten IDs versehen.

Darüber hinaus werden demografische, klinische Merkmale und Labordaten erfasst.

Für alle eingeschlossenen Patienten zeichnen Ärzte die folgenden Daten auf:

-Vertraute Geschichte von CRC; -Komorbiditäten; -Drogeneinnahme; -Gastrointestinale (GI) und Alarmsymptome (Eisenmangelanämie, Hämatochezie, unerklärlicher Gewichtsverlust, Bauchschmerzen, plötzliche Änderung der Stuhlgewohnheiten); -Ernährungsgewohnheiten; -Rauchen und Alkoholkonsum; -BMI; -Quantitative FIT-Daten; -Informationen über frühere FIT und/oder Koloskopien und/oder virtuelle Koloskopien

Alle eingeschlossenen Patienten werden innerhalb von 4 Wochen nach dem positiven FIT einer Koloskopie unterzogen, nachdem die endoskopischen Merkmale der Koloskopie (Größe, Lage, Form basierend auf der Pariser Klasse) vorliegen. und histopathologische Merkmale der erkannten Läsionen werden gesammelt.

Fortgeschrittene kolorektale Adenome werden definiert als Adenome größer oder gleich 10 mm und/oder mit Zottenanteilen von mehr als oder gleich 25 % und/oder hochgradiger Dysplasie.

Darüber hinaus werden Patienten, bei denen CRC diagnostiziert wurde, auch einem Ganzkörper-CT-Scan unterzogen, um die Krankheit einzustufen, und in der klinischen Praxis an einen onkologischen Behandlungspfad überwiesen. Dabei werden folgende Daten erhoben: Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und Organmetastasen, TNM-Klasse.

Die Einschreibungsphase dauert 20 Monate.

Am Ende der Einschreibungsphase werden die Forscher die Mikrobiomanalyse durchführen und klinische, endoskopische und mikrobielle Daten durch statistische und maschinelle Lernalgorithmen kombinieren, um spezifische mikrobielle Biomarker zu identifizieren, die mit CRC und fortgeschrittenen kolorektalen Adenomen assoziiert sind, um ein neues zu entwickeln Diagnosetool, basierend auf einem Bewertungssystem. Die Analysephase dauert 4 Monate.

Die Studienergebnisse werden im entsprechenden Abschnitt dieser Website detailliert beschrieben.

Die Mikrobiomanalyse wird mit Shotgun-Sequenzierungstechniken durchgeführt. Um darüber hinaus eine Reihe mikrobieller Arten zu erhalten, die hauptsächlich mit CRC und fortgeschrittenen kolorektalen Adenomen assoziiert sind, werden die Forscher Anwendungen des maschinellen Lernens nutzen, beispielsweise unter Verwendung der weit verbreiteten Random-Forest-Algorithmen, sowie metaanalytische Ansätze, die unsere große Kohorte mit zuvor veröffentlichten integrieren metagenomische Kohorten. Eine definierte Gruppe mikrobieller Spezies, die hauptsächlich mit Darmkrebs und fortgeschrittenen kolorektalen Adenomen assoziiert sind, wird einen umfassenden Risikoscore basierend auf Mikrobiommerkmalen liefern, mit zwei spezifischen Zielen: die Genauigkeitstests des FIT-Diagnosetools zu verbessern und für Kliniker leicht interpretierbar zu sein.

Alle gesammelten klinischen Daten werden statistisch kombiniert, um die mikrobiellen Merkmale von den am häufigsten bis zu den am wenigsten assoziierten Merkmalen einzustufen. Diese Rankings werden genutzt, um ein Mikrobiomprofil eines neuen Individuums auszuwerten und um zu berichten, wie viele der im vorherigen Panel definierten Arten gefunden und somit mit CRC und fortgeschrittenen kolorektalen Adenomen in Verbindung gebracht werden. Assoziationen zwischen identifizierten Arten und Interessenträgern werden durch robuste statistische Analysemethoden wie partielle Korrelation oder lineare Modellierung geschätzt. Anschließend werden die Assoziationen in eine Rangfolge gebracht und anhand von Markern für dieselbe Art verglichen, wobei für jede Art eine Prioritätsbewertung ermittelt wird. Besonderes Augenmerk wird auf die Identifizierung potenzieller Störmarker gelegt, die bekanntermaßen mit Unterschieden in der Zusammensetzung des Mikrobioms, beispielsweise dem Alter, zusammenhängen und stattdessen als Kovariaten in der statistischen Modellierung verwendet werden sollten. Zusätzlich zur statistischen Modellierung werden Assoziationen zwischen Arten und Markern auch über ML-Ansätze bewertet, insbesondere solche, die Merkmalswichtigkeitswerte für die Eingabemerkmale (in unserem Fall Arten) liefern, die zur Einstufung der Arten über die verschiedenen Marker hinweg verwendet werden können ( z.B. Random Forest, LASSO usw.).

Kontinuierliche Variablen werden als Mittelwert ± Standardabweichung oder als Median und Interquartilbereich (IQR) angegeben, und kategoriale Variablen wurden als Häufigkeit und Prozentsatz zusammengefasst. Vergleiche von Variablen werden je nach Bedarf mittels T-Test (oder Mann-Whitney/Kruskal-Wallis), Chi-Quadrat-Test oder exaktem Fisher-Test durchgeführt. Ein p-Wert <0,05 wird als Hinweis auf statistische Signifikanz angesehen. Es werden logistische Regressionsmodelle durchgeführt, um das Vorhandensein von Variablen zu identifizieren, die unabhängig mit den Ergebnissen verbunden sind. Die in den Modellen berücksichtigten Variablen wurden durch schrittweise Modellauswahl ausgewählt und orientierten sich an der klinischen Relevanz. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS v. 28.0 für Macintosh (SPSS Inc., Chicago, USA) durchgeführt. Die Forscher werden ein Framework für maschinelles Lernen (ML) verwenden, das auf dem Scikit-Learn-Python-Paket basiert und einen Kreuzvalidierungsansatz mit 100 Bootstrap-Iterationen und einer 80/20-Zufallsaufteilung in Trainings- und Testfalten verwendet. Klassifizierungs- und Regressions-ML-Algorithmen werden sowohl auf taxonomische relative Häufigkeiten auf Mikrobiom-Artenebene als auch auf funktionelle Potenzialprofile trainiert. Taxonomische Häufigkeiten auf Artenebene werden von MetaPhlAn 4 (unter Verwendung der neuesten verfügbaren Datenbanken, derzeit mit dem Namen „Okt22“) geschätzt und mithilfe der arcsin-sqrt-Transformation für Zusammensetzungsdaten normalisiert. Funktionspotenzialprofile werden mithilfe der neuesten HUMAnN 4-Version geschätzt und die Forscher werden sowohl Häufigkeitsschätzungen einzelner mikrobieller Genfamilien als auch von Stoffwechselwegen berücksichtigen. Teilkorrelationen zwischen Arten und Markern werden mithilfe des Spearman-Index berechnet, um Verzerrungen aufgrund von Ausreißerwerten zu vermeiden, und um Kovariaten wie Geschlecht, Alter und Body-Mass-Index korrigiert, die bekanntermaßen einen Einfluss auf die Zusammensetzung des Mikrobioms haben. Teilkorrelationswerte werden mithilfe des Benjamini-Hochberg-Verfahrens für die Falscherkennungsrate korrigiert.