出生前および産科期の母親の曝露と幼少期の膵島自己抗体 (PROMISE)

私たちは、子孫にT1Dの一親等血縁者（FDR）（母親、父親、または完全な兄弟）がいる出生前コホートを組み立てます。 十分な参加者を登録するために、コロラド州オーロラのバーバラ・デイビス糖尿病センター（BDC）[調整センター]、ニューヨーク州ニューヨークのマウント・サイナイ病院、ジョスリン糖尿病センター（JDC）で多施設共同研究を実施しています。マサチューセッツ州ボストンとオハイオ州コロンバスのオハイオ州立大学 (OSU) にあります。 これらの施設は、これまでの成功した協力の歴史、確立された大規模な T1D 患者集団へのアクセスに基づいて選択されました（これらのセンターは、T1D 患者の妊娠ケアに関しては米国最大の施設の 1 つであり、成人と小児のセンターもあります）クリニック）、産科実践との部位固有のつながり、研究コホートへの採用成功の歴史。 指名された 4 つの研究施設に加えて、採用を確実に成功させるために、追加の候補施設にもアプローチしてきました。 私たちはヨギシュ・クドヴァ氏の指導の下、メイヨークリニック医科大学に追加の候補地を特定しており、この 4 つの施設での助成金の初年度の採用が期待を下回った場合に備えて、このサイトは募集を開始する準備ができています。 私たちの目標は、この最初の資金提供期間中に 800 人の妊娠コホートを集め、フェーズ 2 とフェーズ 3 でさらに最大 1,200 人を登録することです (合計 N=2,000)。

D. 手順とデータ収集ツールの説明、リスク、正当性:

スクリーニングと同意の手順: 参加者はスクリーニング、同意 (紙および電子的な同意プロセスを通じて利用可能) を受け、HIPAA に準拠し、インターネット アクセスがあればどこからでもアクセスできる電子調査機能を備えたオンライン データベース (REDCap) を通じてアンケートに回答します。 必要に応じて、クリニック内でタブレットを使用して REDCap アクセスを提供できます。 私たちは、調査収集を伴う数多くの研究にREDCapデータベースシステムを使用して成功しており、Covid-19パンデミック中のT1D成人（妊婦を含む）の研究ではオンラインスクリーニングと同意手順を広範囲に使用してきました。 研究スタッフは、状況に応じて、電話、Zoom などの HIPAA 準拠のビデオ プラットフォームを使用して、または直接対面して、潜在的な参加者と同意書を確認することができます。 スクリーニングの質問には、妊婦または胎児の父親/兄弟における T1D の病歴、母親の年齢、および現在の妊娠日 (最終月経日、出産予定日) を含む妊婦の産科病歴が含まれます。

訪問および検体収集スケジュール: 研究訪問および検体収集 (表 2) は、研究施設の 1 つで、父親については 1 つの時点で、母親については 4 つの時点でスケジュールされます。妊娠中期（14～28週未満）、妊娠中期（28週以上）、産後12週間まで。 医療記録は、妊娠、出産、産後の訪問、および乳児の出生記録については医療記録公開フォームを使用して取得されます。 すべての研究施設は、病院ネットワーク内で出産する研究参加者の出生前ケアと出産に関する医療記録を研究者が取得できる電子医療記録 (EHR) にアクセスできます。また、すべての研究施設にはプロトコルが整備されており、外部施設から記録を取得する経験があります。医療記録リリースフォーム。 BDC 調整センターでは、これまでに妊娠、出産、乳児の出生記録の医療記録を収集し、これらのデータを REDCap データベースに抽象化しました。 この研究では、産科および新生児の記録を抽出するための確立された手順に従います。 BDC 提供者に報告されるこの研究に含まれる女性の母体および胎児の転帰は、EHR チャートの手作業によるチャートレビューによって取得されます。 EPIC を利用し、患者が記録の共有を承認した病院システムにおける母子入院は、EPICS の相互運用可能な共有ツール Care Everywhere を通じて表示できます。 記録の手動レビューは、特定の結果の尺度を取得するために使用されます。

品質管理基準を維持し、スタッフのトレーニングと監督を合理化するために、すべての記録はバーバラ デイビス センターで収集および要約されます。

妊娠中の訪問：研究の対象となる妊婦は、可能であれば妊娠第 1 期（妊娠 14 週以前）に登録されますが、登録後の早期流産の可能性を減らすため、妊娠 8 週以降に登録されます。 父親も同時に登録され、可能であれば、女性の最初の妊娠訪問と同時に研究訪問（最大33 mlまたは大さじ2 1/4の血液サンプルを含む）を完了するよう求められます。可能。 この研究について連絡を受けた時点ですでに第 2 学期（最大 24 週）に入っている女性が登録され、第 2 学期と第 3 学期の訪問および産後訪問を完了することになります。 体重や血圧などの定期的な妊娠訪問データはクリニックまたは医療記録から収集されます。 体重や血圧、定期的な臨床検査（T1D の女性の HbA1c、脂質など）を含む定期的な妊娠訪問データがクリニックまたは医療記録から収集されます。 研究訪問のタイミングと手順を以下の表 3 に示します。

検体の収集: サンプルは、参加する診療所で各研究訪問時に収集されます。 外部センターは、保管のためにすべてのサンプルを BDC に発送します。 サンプル収集は、すべてのサイトで一貫した収集を保証するために、業務マニュアルで標準化されます。 さらに、サンプルの収集、タイミング、種類は、既存のコホート、特に ENDIA 研究で完了した収集と同様になるように慎重に設計されており、研究全体で結果を比較できるようになりました。 ただし、妊娠期間ベースおよび産後の来院のタイミングは、当院の標準治療によって決定されるため、ENDIA 研究と正確に一致しない場合があります。 たとえば、女性は通常、私たちの臨床センターでの産後訪問を 4 ～ 6 週間で完了するため、参加者の負担を最小限に抑えるために、産後データとサンプル収集を同時にスケジュールします。 ENDIA 研究では、母親は生後 3 か月で産後訪問を受けました。

瀉血により、最大 33 ml または大さじ 2 1/4 の血液サンプルが採取されます。 血漿はEDTAチューブに収集され、氷上に保管され、遠心分離によって分離されます。 血清はゲルの入った血清分離チューブに収集され、凝固させた後、遠心分離によって分離されます。 血清および血漿は、２ｍｌの凍結バイアルに等分され、－８０℃で保存される。バフィーコートは、将来のＤＮＡおよびメチル化研究のために来院のたびに保存される。 血液 RNA サンプルは Tempus™ チューブを使用して収集されます。これにより、遺伝子発現解析のために全血からのトータル RNA の安定化と単離が可能になります。 これらのサンプルは室温で最大 5 日間保存でき、その後 4°C で凍結します。 オプションの膣スワブは、CultureSwab 輸送システムを使用して参加者が自己収集します。 オプションの便サンプルは、OMNIgene_GUT などの市販の便収集キットを使用して参加者が自己収集します。

アンケートの収集: 参加者は、診療所での訪問を完了する研究参加者の直接の予約を完了するために必要な時間を短縮し、データ収集/入力手順を合理化し、データの収集/入力手順を合理化し、訪問のたびに REDCap データベース プログラムを使用してオンラインでアンケートに回答するように求められます。データ入力エラー。 アンケートには、検証済みの食事頻度アンケート43を使用した食事摂取、検証済みのアンケート44、45を使用したタバコとアルコールが含まれ、一般的な[患者健康アンケート-8]46および周産期[エディンバラ産後うつ病スケール]47のうつ病に対処するスクリーニングアンケートを収集します。 これらのアンケートのいずれかでスクリーニング陽性（PHQ8 スコア 14 以上、またはエディンバラ産後うつ病スコア 10 以上）の女性は、さらなる評価のために通常の医療提供者に紹介されます。

T1D の母親と父親では、T1D 苦痛スケール (T1-DDS)、糖尿病の自己管理、および低血糖の恐怖の評価が、検証済みの機器を使用して評価されます。 T1D の父親は 1 回の来院でアンケートに記入するのに対し、T1D の母親は各研究来院時 (学期ごとに 1 回、および産後) にこれらのアンケートに記入するよう求められます。 合併症および血糖コントロールの判定のために、登録前 1 年間の HbA1cs およびその他の臨床検査 (脂質、尿中アルブミン対クレアチニン比、血清クレアチニン)、網膜症検査および検査記録を含む糖尿病治療記録が要求されます。

妊娠歴と転帰: 妊娠の母体と胎児の転帰に関するデータを医療記録とともに収集します。分娩および分娩のための各入院の記録を取得することにより、分娩時の在胎週数、乳児の出生体重、分娩合併症、および母体と胎児の転帰を取得します。 これらの病院記録のバックアップとして、また医療記録にアクセスできない場合（女性が電子医療記録のエリア外に移動し、医療記録リリースを使用して記録を取得できない場合など）に備えて、同じものを収集します。以前の妊娠研究の 1 つのために開発した調査を使用したデータ。 出産日、在胎期間、乳児の出生体重と身長、乳児の生活状態、乳児の性別、早産、分娩の種類、16 件の特定の妊娠合併症、15 件の特定の分娩合併症、5 件の新生児合併症、および病院への入院について質問します。新生児集中治療室（NICU）。 母乳育児の実践は産後訪問時に収集されます。 また、T1D の女性の妊娠前の健康情報 (血圧、腎機能、網膜症、身長、体重) について、カルテのレビューを通じてデータを収集します。 妊娠年代測定のために行われた超音波の記録を取得することで、妊娠年代を検証します。

T1D 患者の血糖因子: HbA1c および血糖値 (CGM および血糖測定器のダウンロード)、現在のインスリン投与量およびインスリン投与方法は、妊娠中の定期診察中に収集され、医療記録から収集されます。 また、定期的な妊娠訪問中に CGM デバイスからダウンロードされたデータ (CGM を定期的に使用する女性の場合) にアクセスして、関連する血糖値の範囲で費やした時間 (範囲内の時間: 63 ～ 140 mg/dL [妊娠中)] などの血糖変動の指標を評価します。 ]および70〜180 mg/dL [産後]、低血糖: <63 mg/dL [妊娠]および<70 mg/dL [産後]、高血糖: >140 mg/dL [妊娠]および>180 mg/dL [分娩後]50、変動係数、SD)。

臍帯血と便の採取：臍帯血は出生時および外部環境（母乳育児や哺乳瓶による授乳、細菌への曝露など）にさらされる前に乳児の DNA メチル化を検査するのに理想的なサンプルであるため、20 ml までの臍帯血の採取が優先されます。初期の生命中に得られたその後のサンプルとは対照的に、微生物やその他の環境要因。 臍帯血の採取は、我々のこれまでの研究では、スクリーニング病院との契約を通じて、またサンプルを取得して郵送するために母親に送られる臍帯血採取キットの使用を通じて達成されていた。 このコホートでは女性が全国の任意の数の病院で出産することを考慮して、確立されたプロトコールに従って、サンプルの採取と返却に関する詳細な指示を添えた臍帯血採取キットを妊婦に送付/提供する予定です。 臍帯血の採取ができない場合には、出生後できるだけ早く（できれば出産後1週間以内）、最大1mlのヒールスティックサンプルを採取できるキットを同梱します。 また、女性には出産後すぐに便/胎便サンプルを採取できる便キットを提供する予定です。

子孫の高リスク遺伝子型のスクリーニング: 新生児は、生後 1 週間以内に採取された乾燥血液スポットのコレクションを使用して、出生時の T1D の遺伝的リスクについてスクリーニングされます。 サンプルは、T1D、特に早期発症型 T1D のリスクを識別することが示されている 67 個の一塩基多型 (SNP) のパネルである遺伝的リスク スコア 2 (GRS2) を決定するために、ウィリアム ハゴピアン博士の研究室に送られます。 (AUC 0.96)1. 高リスクのヒト白血球抗原 (HLA) 遺伝子型は、IA および T1D のリスクと強く関連していますが、GRS2 の使用は、高リスクの HLA 遺伝子型のみをスクリーニングするよりもほぼ 2 倍効率的であることが実証されています。 このリスク スコアの使用は、新生児スクリーニングのより効率的な方法として提案されており、特に幼児期に、IA および T1D を発症するリスクが最も高い小児を綿密にモニタリングできるようになります。 子孫に対するすべての訪問と手順を表 4 に示します。

TEDDY 研究のデータに基づくと、一般集団の 90 パーセンタイルに相当するリスクを与える GRS2 により、FDR を有する TEDDY 参加者の 23% が高リスクであることが特定されました (一般集団の 10%)。 FDR を持つ TEDDY 参加者が高リスク HLA 遺伝子型に基づいて選択されたことを考慮すると、この提案された出生前コホート (HLA リスクに関係なくすべての FDR が登録される) における GRS2 スコアに基づいて高リスクと特定される割合はわずかに減少すると推定されます。 TEDDY で観察されたパーセンテージよりも低い。 したがって、提案されている妊娠コホートの FDR 子孫の約 20% が高リスクと特定され、低リスクの子孫よりも綿密に追跡調査されると推定しています。

GRS2のリスクが最も高い小児（例、一般集団のリスクスコアの90％に相当するリスクよりも高い）は、2歳までは6か月ごと、その後は5～6歳まではIAスクリーニングと遺伝子マーカーの保存のために採血を受けます。年。

GRS2 のリスクが低い小児は、2 歳と 5 ～ 6 歳のときに IA スクリーニングのために採血を受けます。 HLA ジェノタイピングと IA 検査は、以前に報告されたように、BDC の臨床免疫学研究室 (NIH/NIDDK 指定の北米自己抗体/HLA コア) で行われます 40。 他の血液サンプルは、DNA メチル化、Virscan、および将来のメタボローム/プロテオミクス マーカーの症例対照研究のために保存されます。

乳児の成長と健康: 乳児の成長データは、REDCap 調査による親の自己申告、および小児記録の医療記録要求を通じて取得されます。 予防接種記録が取得されます。 2歳になるまで6か月ごとに、クリニック訪問時に高リスクグループから臨床測定値（最大20mlまたは大さじ1杯強の血液の採取を含む）、病気、および乳児/小児の授乳方法が収集されます。このデータは、低リスク グループに対する REDCap アンケートによって収集されます。

膵島自己抗体の評価: 研究全体 (全段階) の主な結果の尺度は、小児における膵島自己抗体 (IA) の持続的な陽性反応です。 血清サンプルは、生後6、12、18、24ヶ月および5～6歳の高遺伝リスク子孫における4つの膵島自己抗体の測定のために採取される。 遺伝的リスクの低い子孫は生後24か月と5～6歳の時点で検査を受ける。 サンプルは収集、処理され、IA の測定のために外部サイトから BDC に送信されます。 血清はアッセイまで-70℃で保存します。 IAは生後1年という早い時期に発症する可能性があり、T1Dはより若い年齢で診断されることが多いため、高リスクの子孫ではIAをより頻繁にモニタリングする必要がある。 したがって、以下に説明するように、IA と血糖異常の進行 (ステージ 2 T1D) の両方を監視する予定です。

IA アッセイは、Liping Yu 医学博士の指導の下、Barbara Davis Center Core Autoantibody Laboratory で IAA、GADA、IA-2A、および ZnT8A のコード化されたサンプルに対して実施されます。 この研究室は CLIA 認定および CAP 認定を受けており、NIH/NIDDK 北米自己抗体/HLA コア研究所として指定されています。 過去数十年にわたり、バーバラ デイビス センター自己抗体研究室は、TEDDY 研究、TrialNet、DPT-1、T1DGC、ITN などを含む、数多くの主要な T1D 臨床試験を行ってきました。 GAD65 および IA-2 のアッセイは、NIH/NIDDK 糖尿病自己抗体調和委員会と協力して、DK 単位/ml (NIDDK 単位) で表される共通の抗体単位を使用した標準アッセイ プロトコールを使用して最近調和されました。 これにより、世界中の異なる研究所間で進行中の国内/国際試験のすべてで自己抗体検査の結果を比較できるようになりました。 BDC の自己抗体/HLA コア施設は、これらの調和されたアッセイプロトコルの達成を支援する 3 つの国際研究所のうちの 1 つです。 すべての陽性サンプルと陰性サンプルの 5% は盲検二重検査を受けます。 IAは、2回以上の連続来院で4つの膵島自己抗体のうち少なくとも1つが陽性であるか、またはT1Dの診断に続く1回の検査陽性と定義されます。 最初の自己抗体検査で陽性反応が出た小児は、最初の検査後できるだけ早く再確認検査を受けるよう求められます。

血糖異常のモニタリング：家族はT1Dの兆候や症状について教育され、子どもの潜在的な兆候や症状に関する懸念や質問があれば研究スタッフに連絡して報告するよう指示される。 IAを発症した子供の家族には、この研究への資金提供がまだ有効であると仮定して、教育、モニタリング、膵島に関連する危険因子を説明するための教材を含む支援のためのASK追跡調査への登録のために、ASK研究チームへのアクセスが提供されます。自己抗体の状態、進行を監視するために 3 ～ 6 か月ごとに自己抗体と HbA1c を繰り返し検査します。無料の血糖計、ストリップ、トレーニングが提供されます。 連続血糖モニターは 3 ～ 6 か月ごとに無料で提供されます。 さらに、同じくヘルムズリー慈善信託の資金提供によるASK the Experts全国監視プログラムは、バーバラ・デイビス教育センターのASK the Expertsチームと連携して活動できる地元の医療提供者または小児内分泌学者がいる家族が利用できるようになります。モニタリングとサポート。 ASK/ASK the Experts 研究への資金提供が終了した場合、3 ～ 6 か月ごとの HbA1c 測定、無料の血糖計、グルコース ストリップ、トレーニングなど、同じ教育とサポートがこの研究プロトコルを通じて提供されます。

ウイルス曝露評価: Virscan アッセイを使用して、母親と子のウイルス曝露を長期的に評価します。 最初の 3 年間の研究期間分析では、妊娠および産後の各学期中の来院からの血清サンプルと、選択された高リスク乳児から生後 6 か月の時点で採取された血清サンプル (データ分析計画に記載) が検査されます。 Virscan 汎ウイルス血清学的監視ツール。 このプラットフォームは、ヒト病原性ウイルスのプロテオームワイドペプチドを含む菌相ライブラリーを使用するファージ免疫沈降シーケンス (PhIP-seq) テクノロジーに基づいています。 Virscan ライブラリには、最も既知の病原性ヒト ウイルス (約 400 種および株) を表すペプチドのほか、国立アレルギー感染症研究所の免疫エピトープ データベース (www.iedb.org) にリストされている他の抗原が含まれています。 すべての段階が完了し、十分な数の子がIAを発症した後の長期研究の目標は、IAを発症した母親と子のウイルス曝露と年齢およびHLAが一致する対照群のケースコントロール研究を実施することです。 IAを発症していない子孫。

血清学的スクリーニングを実行するには、血清サンプルをライブラリーと混合して、抗体がファージ表面に表示される病原体特異的エピトープと結合できるようにします。 次に、バクテリオファージと抗体の複合体が免疫沈降され、抗体が結合した人工的に発現されたペプチド抗原をコードするファージ DNA 領域が NGS によって配列決定され、所定の血清サンプル中の抗ウイルス抗体のレパートリーが明らかになります。 広範囲の病原体に対する抗体を検出するデータ分析は、血清検体中の病原体特異的ペプチドの相対的濃縮の統計的評価 (p 値) に依存します。 したがって、結果として得られるデータは本質的に定性的なものであり、従来の単一血清学的方法から得られる抗体力価と直接比較することはできません。

エピジェネティック研究および遺伝子発現研究：DNAメチル化は母体の末梢全血で測定され、遺伝子発現（RNA）は妊娠中および産後に採取された全血RNAサンプル、および出産前の幼少期に採取された子の全血およびRNAサンプルで測定されます。 IAの開発。 DNA メチル化と遺伝子発現の測定は、最初の 3 年間の研究期間で、T1D の母親の子供 (n=86) の臍帯血で、T1D の父親を持つが母親が糖尿病ではない子供 (N=86) と比較されます。母体の年齢とHLAリスクに合わせたケースコントロールデザインで。 すべての段階が完了した後の長期解析の目標は、症例対照研究デザインでエピジェネティックな変化と遺伝子発現を調査し、持続的にIA陽性である乳児の中からIA症例を選択し、年齢とHLAリスクが一致した対照の中からIA症例を選択することです。 。 メチル化の定量化は、前述したように Infinium HumanMmethylation450K Beadchip (「450 K」) および Infinium MmethylationEPIC Beadchip (「EPIC」) を使用して実行されます 41。 コロラド大学アンシュッツ メディカル キャンパスには最先端の施設があり、RNA バイオサイエンス イニシアティブ (https://medschool.cuanschutz.edu/rbi) を立ち上げました。 RNA 検査と情報学のリソースを組み合わせることで、「アンシュッツ メディカル キャンパスでの基礎から臨床 RNA 研究までの流動的なパイプライン」を提供することを目標としています。