Пренатальное и акушерское воздействие на мать и островковые аутоантитела в раннем возрасте (PROMISE)

Мы соберем пренатальную когорту, в которой у потомства есть родственник первой степени родства (FDR) с СД1 (мать, отец или родной брат или сестра). Чтобы набрать достаточное количество участников, мы проводим многоцентровое исследование в Диабетическом центре Барбары Дэвис (BDC) в Авроре, штат Колорадо [координационный центр], в больнице Маунт-Синай в Нью-Йорке, штат Нью-Йорк, в Диабетическом центре Джослин (JDC). в Бостоне, Массачусетс, и Университете штата Огайо (OSU) в Колумбусе, Огайо. Эти центры были выбраны на основе истории успешного предыдущего сотрудничества, доступа к большим устоявшимся группам людей с СД1 (эти центры являются одними из крупнейших в Соединенных Штатах в отношении ухода за беременными женщинами с СД1, а также имеют взрослые и педиатрические центры). клиники), связи с акушерской практикой в ​​конкретных местах и ​​история успешного набора в исследовательские когорты. В дополнение к четырем указанным исследовательским центрам мы обратились к другим потенциальным местам, чтобы обеспечить успех при наборе персонала. Мы определили дополнительный потенциальный участок в Медицинском колледже клиники Майо под руководством Йогиша Кудва, и этот участок готов активировать, если набор персонала в первый год действия гранта на четырех участках не оправдает ожиданий. Наша цель — собрать когорту беременных из 800 человек в течение этого первоначального периода финансирования и зачислить еще 1200 на этапы 2 и 3 (всего N = 2000).

D. Описание, риски и обоснование процедур и инструментов сбора данных:

Процедуры проверки и согласия: участники будут проверены, получат согласие (доступное в бумажном и электронном виде) и заполнят анкеты через онлайн-базу данных с возможностями электронного опроса (REDCap), которая соответствует требованиям HIPAA и к которой можно получить доступ в любом месте, где есть доступ в Интернет. При необходимости доступ к REDCap можно предоставить в клинике с помощью планшета. Мы успешно использовали систему базы данных REDCap для многочисленных исследований, включающих сбор опросов, а также широко использовали процедуры онлайн-скрининга и получения согласия в исследованиях взрослых с СД1 (включая беременных женщин) во время пандемии Covid-19. Сотрудники исследования будут готовы просмотреть форму согласия с потенциальными участниками по телефону, с использованием видеоплатформы, соответствующей требованиям HIPAA, такой как Zoom, или лично, в зависимости от обстоятельств. Скрининговые вопросы будут включать историю СД1 у беременной женщины или отца/брата или сестры плода, возраст матери и акушерский анамнез беременной женщины, включая текущие даты беременности (дата последней менструации, ожидаемая дата родов).

График посещений и сбора образцов: Учебные посещения и сбор образцов (Таблица 2) будут запланированы в одном из исследовательских центров, в один момент времени для отцов и в четыре момента времени для матерей: первый триместр (8-<14 недель), второй триместр (14–<28 недель), третий триместр (28+ недель) и до 12 недель после родов. Медицинские записи будут получены с использованием форм медицинских записей о беременности, родах и послеродовых визитах, а также о рождении младенцев. Все исследовательские центры имеют доступ к электронным медицинским записям (ЭМК), что позволит исследователям получать медицинские записи о дородовом уходе и родах для участников исследования, которые рожают в пределах своей больничной сети, и во всех исследовательских центрах имеются действующие протоколы и имеется опыт получения записей из сторонних учреждений с использованием формы выдачи медицинских документов. В координационном центре BDC мы предварительно собрали медицинские записи о беременности, родах и рождении младенцев и поместили эти данные в базы данных REDCap. Мы будем следовать установленным процедурам извлечения акушерских записей и записей новорожденных для этого исследования. Результаты для матери и плода женщин, включенных в это исследование, о которых сообщается поставщикам услуг BDC, будут получены путем ручного анализа диаграмм EHR. Информация о госпитализациях матери и плода в любой больничной системе, использующей EPIC, а также о том, для кого пациенты разрешают обмен записями, можно просмотреть с помощью совместимого инструмента обмена данными EPICS под названием Care Everywhere. Ручной просмотр записей будет использоваться для получения конкретных показателей результатов.

Все записи будут собираться и обрабатываться в Центре Барбары Дэвис для поддержания стандартов контроля качества и оптимизации обучения и надзора за персоналом.

Визиты для беременных: Беременные женщины, имеющие право на участие в исследовании, будут включены в первый триместр (до 14 недель беременности), если это вообще возможно, но после 8 недель беременности, чтобы уменьшить вероятность прерывания беременности на ранних сроках после включения в исследование. Отцы будут зачислены в то же время, и им будет предложено завершить свой ознакомительный визит (включая анализ крови объемом до 33 мл или 2 1/4 столовых ложек крови) одновременно с первым визитом женщины во время беременности, если он вообще состоится. возможный. Женщины, которые уже находятся во втором триместре (до 24 недель), когда к ним обратится по поводу исследования, будут включены в исследование и пройдут визиты во втором и третьем триместрах, а также послеродовой визит. Данные о плановых посещениях беременных, включая вес и артериальное давление, будут собираться в клинике или из медицинской документации. Данные планового посещения беременных, включая вес и артериальное давление, рутинные лабораторные анализы (включая HbA1c для женщин с СД1, уровень липидов и т. д.) будут собираться в клинике или из медицинской документации. Время и процедуры ознакомительного визита показаны в Таблице 3 ниже.

Сбор образцов: Образцы будут собираться при каждом исследовательском визите в участвующую клинику. Внешние центры отправят все образцы в BDC на хранение. Сбор проб будет стандартизирован в нашем Руководстве по эксплуатации, чтобы обеспечить единообразный сбор на всех объектах. Кроме того, сбор образцов, сроки и типы были тщательно разработаны, чтобы быть похожими на сбор образцов, выполненный в существующих когортах, в частности в исследовании ENDIA, чтобы обеспечить возможность сравнения результатов разных исследований. Однако время визитов в триместр и после родов определяется стандартами медицинской помощи в наших клиниках и может не совсем соответствовать данным исследования ENDIA. Например, в наших клинических центрах женщины обычно посещают послеродовой период через 4–6 недель, поэтому мы планируем одновременно собирать послеродовые данные и сбор образцов, чтобы минимизировать нагрузку на участников. В исследовании ENDIA матери проходили послеродовой визит через 3 месяца.

Образец крови объемом до 33 мл или 2 ¼ столовых ложек крови будет получен путем флеботомии. Плазму собирают в пробирки с ЭДТА, хранят на льду и отделяют центрифугированием. Сыворотку собирают в пробирки для разделения сыворотки с гелем и отделяют центрифугированием после того, как ей дадут сгуститься. Сыворотку и плазму разливают в криопробирки по 2 мл и хранят при температуре - 80°C. Лейкоциты будут сохраняться при каждом посещении для будущих исследований ДНК и метилирования. Образцы РНК крови будут собираться с использованием пробирок Tempus™, которые позволяют стабилизировать и выделить общую РНК из цельной крови для анализа экспрессии генов. Эти образцы можно хранить до пяти дней при комнатной температуре, а затем заморозить при температуре 4°C. Дополнительные вагинальные мазки участники будут собирать самостоятельно с помощью транспортной системы CultureSwab. Дополнительные образцы стула участники будут собирать самостоятельно, используя коммерчески доступный набор для сбора стула, такой как OMNIgene_GUT.

Сбор анкет: участникам будет предложено заполнять анкеты онлайн с использованием программы базы данных REDCap для каждого посещения, чтобы сократить время, необходимое для прохождения личных встреч с участниками исследования, завершающими посещения клиник, а также упростить процедуры сбора/ввода данных и сократить ошибки ввода данных. Анкеты будут включать информацию о потреблении пищи с использованием утвержденного опросника по частоте приема пищи43, табакокурении и алкоголе с использованием утвержденных опросников44,45, а также мы соберем скрининговые анкеты, касающиеся общей [Опросник о состоянии здоровья пациента-8]46 и перинатальной [Эдинбургской шкалы послеродовой депрессии]47 депрессии. Женщины, показавшие положительный результат (показатель PHQ8 14 или выше или показатель Эдинбургской послеродовой депрессии 10 или выше) по любому из этих опросников, будут направлены к своему постоянному врачу для дальнейшего обследования.

Среди матерей и отцов с СД1 оценки по шкале дистресса СД1 (T1-DDS), самоконтролю диабета и страху гипогликемии будут оцениваться с использованием проверенных инструментов. Отцы с СД1 будут заполнять анкеты за одно посещение, тогда как матерям с СД1 будет предложено заполнять эти анкеты при каждом исследовательском визите (один раз в триместр и после родов). Для определения осложнений и контроля гликемии будут запрошены записи о лечении диабета, включая HbA1cs и другие лабораторные анализы (липиды, соотношение альбумина и креатинина в моче, креатинин сыворотки), исследования ретинопатии и записи обследований за год до регистрации.

История беременности и исходы: мы соберем данные об исходах беременности для матери и плода с помощью медицинских записей; мы получим гестационный возраст при родах, вес ребенка при рождении, осложнения при родах, а также исходы для матери и плода, получив записи о каждой госпитализации по поводу схваток и родов. В качестве резервной копии этих больничных записей и в случае, если мы не сможем получить доступ к медицинским записям (например, если женщина выйдет за пределы нашей зоны электронных медицинских карт, и мы не сможем получить записи, используя выдачу медицинских записей), мы соберем те же данные. данные с использованием опроса, который мы разработали для одного из наших предыдущих исследований беременности. В нем запрашиваются дата родов, гестационный возраст, вес и рост ребенка при рождении, жизненный статус ребенка, пол ребенка, преждевременные роды, тип родов, 16 конкретных осложнений беременности, 15 конкретных осложнений родов, 5 конкретных неонатальных осложнений и госпитализация в отделение интенсивной терапии новорожденных (ОИТН). Информация о практике грудного вскармливания будет собрана во время послеродового визита. Мы также будем собирать данные посредством анализа медицинских карт для получения информации о состоянии здоровья женщин с СД1 до беременности (артериальное давление, функция почек, ретинопатия, рост и вес). Мы проверим срок беременности, получив записи УЗИ, проведенного для датирования.

Гликемические факторы среди женщин с СД1: значения HbA1c и глюкозы (загружаемые данные CGM и глюкометра), текущая дозировка инсулина и метод введения инсулина собираются во время обычных посещений беременных и будут собираться из медицинской документации. Мы также будем получать доступ к данным, загруженным с устройств CGM (для тех женщин, которые регулярно используют CGM) во время обычных посещений беременных, чтобы оценить показатели вариабельности гликемии, такие как время, проведенное в соответствующих диапазонах уровня глюкозы (время в диапазоне: 63-140 мг/дл [беременность ] и 70–180 мг/дл [после родов], гипогликемия: <63 мг/дл [беременность] и <70 мг/дл [после родов] и гипергликемия: >140 мг/дл [беременность] и >180 мг/дл [после родов]50, коэффициент вариации и стандартное отклонение).

Сбор пуповинной крови и стула. Сбор пуповинной крови объемом до 20 мл будет приоритетным, поскольку это идеальный образец для исследования метилирования ДНК у ребенка при рождении и перед воздействием внешней среды, включая грудное вскармливание или кормление из бутылочки, воздействие микробы и другие факторы окружающей среды, в отличие от более поздних образцов, полученных в раннем возрасте. В наших предыдущих исследованиях сбор пуповинной крови осуществлялся по соглашениям со скрининговыми больницами и с использованием наборов для сбора пуповинной крови, отправляемых матери для получения и отправки образцов по почте. Учитывая, что женщины из этой группы будут рожать в любом количестве больниц страны, мы планируем отправить/выдать беременным женщинам комплекты для сбора пуповинной крови с подробными инструкциями по сбору и возврату образцов, используя наш установленный протокол. В случае, если сбор пуповинной крови невозможен, мы предоставим набор для сбора образца крови из пяточной палочки объемом до 1 мл как можно скорее после рождения (желательно в течение недели после родов). Мы также планируем предоставить женщинам наборы стула для сбора образцов кала/мекония вскоре после родов.

Скрининг генотипов высокого риска среди потомства: Новорожденные будут проверяться на генетический риск СД1 при рождении с использованием образцов сухой крови, полученных в течение первой недели жизни. Образцы будут отправлены в лабораторию доктора Уильяма Хагопиана для определения показателя генетического риска 2 (GRS2), панели из 67 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), которые, как было показано, различают риск СД1, особенно с ранним началом СД1. (AUC 0,96)1. Генотипы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) высокого риска тесно связаны с риском ИА и СД1, но было продемонстрировано, что использование GRS2 почти в два раза эффективнее, чем только скрининг на генотип HLA высокого риска. Использование этой шкалы риска было предложено как более эффективный метод скрининга новорожденных, позволяющий более тщательно контролировать детей с самым высоким риском развития ИА и СД1, особенно в раннем детстве. Все посещения и процедуры для потомства показаны в Таблице 4.

На основании данных исследования TEDDY, риск GRS2, эквивалентный 90-му процентилю среди населения в целом, определил 23% участников TEDDY с FDR как высокий риск по сравнению с 10% населения в целом. Учитывая, что участники TEDDY с FDR были отобраны на основе их генотипа HLA с высоким риском, по нашим оценкам, процент идентифицированных как высокий риск на основе показателя GRS2 в этой предлагаемой пренатальной когорте (куда будут включены все FDR независимо от риска HLA) будет немного выше. ниже, чем процент, наблюдаемый в TEDDY. Таким образом, мы подсчитали, что около 20% потомков FDR в предлагаемой когорте беременных будут идентифицированы как люди с высоким риском и за ними будут следить более внимательно, чем за детьми с низким риском.

У детей с самым высоким риском по шкале GRS2 (например, риск выше, чем эквивалент 90% общих показателей популяционного риска) будет собираться кровь для скрининга IA и хранения генетических маркеров каждые шесть месяцев в возрасте до 2 лет, а затем в возрасте от 5 до 6 лет. годы.

У детей с низким риском GRS2 будет взят анализ крови для скрининга IA в возрасте 2 лет и в возрасте 5–6 лет. Генотипирование HLA и тестирование IA будут проводиться в Лаборатории клинической иммунологии BDC (NIH/NIDDK обозначает North American Autoantibody/HLA Core), как сообщалось ранее40. Остальные образцы крови будут сохранены для исследований «случай-контроль» метилирования ДНК, Вирскана и будущих метаболомных/протеомных маркеров.

Рост и здоровье младенцев: данные о росте младенцев будут получены путем самоотчетов родителей посредством опросов REDCap, а также посредством запросов медицинских записей для педиатрических записей. Будут получены записи о прививках. Каждые 6 месяцев до достижения возраста 2 лет у группы высокого риска во время посещения клиники будут собираться клинические измерения (включая сбор до 20 мл или чуть более столовой ложки крови), сведения о заболеваниях и практике кормления младенцев/детей; эти данные будут собраны с помощью анкеты REDCap для группы низкого риска.

Оценка островковых аутоантител. Основным показателем результата всего исследования (все фазы) будет устойчивая положительная реакция на островковые аутоантитела (IA) у ребенка. Образцы сыворотки будут получены для измерения четырех островковых аутоантител у потомков с высоким генетическим риском в возрасте 6, 12, 18, 24 месяцев и 5-6 лет. Потомство с низким генетическим риском будет проверено в возрасте 24 месяцев и 5-6 лет. Пробы будут собраны, обработаны и отправлены с внешних площадок в BDC для измерения IA. Сыворотку хранят при температуре -70°C до проведения анализа. Необходим более частый мониторинг ИА среди потомков высокого риска, поскольку ИА может появиться уже на первом году жизни, а СД1 чаще диагностируется в более молодом возрасте. Поэтому мы планируем контролировать как ИА, так и развитие дисгликемии (стадия 2 СД1), как описано ниже.

Анализы IA будут проводиться на закодированных образцах для IAA, GADA, IA-2A и ZnT8A в основной лаборатории аутоантител Центра Барбары Дэвис под руководством Липин Ю, доктора медицинских наук. Эта лаборатория сертифицирована CLIA, аккредитована CAP и признана основной североамериканской лабораторией по аутоантителам/HLA NIH/NIDDK. За последние несколько десятилетий лаборатория аутоантител Центра Барбары Дэвис провела ряд крупных клинических исследований СД1, включая исследование TEDDY, TrialNet, DPT-1, T1DGC, ITN и другие. Анализы на GAD65 и IA-2 были недавно гармонизированы в сотрудничестве с Комитетом по гармонизации диабетических аутоантител NIH/NIDDK с использованием стандартного протокола анализа с общей единицей антител, выраженной в единицах DK/мл (единицы NIDDK). Это позволило обеспечить сопоставимость результатов тестов на аутоантитела среди всех текущих национальных/международных исследований в различных лабораториях по всему миру. Базовый центр BDC по аутоантителам/HLA является одной из трех международных лабораторий, помогающих выполнять эти гармонизированные протоколы анализа. Все положительные образцы и 5% отрицательных образцов будут подвергнуты слепому дублированному тестированию. ИА будет определяться как положительный результат хотя бы одного из четырех островковых аутоантител при ≥2 последовательных посещениях или один положительный тест с последующим диагнозом СД1. Детям с первоначальным положительным результатом теста на аутоантитела будет предложено прийти на подтверждающий тест как можно скорее после первоначального теста.

Мониторинг дисгликемии: семьи будут проинформированы о признаках и симптомах СД1 и будут проинструктированы связаться с исследовательским персоналом, чтобы сообщить о любых опасениях или вопросах о потенциальных признаках и/или симптомах у их детей. Семьям детей, у которых развилась ИА, будет предоставлен доступ к исследовательской группе ASK, при условии, что финансирование этого исследования все еще активно, для участия в последующем исследовании ASK для обучения, мониторинга и поддержки, включая учебные материалы для объяснения факторов риска, связанных с островковым синдромом. статус аутоантител, повторное тестирование аутоантител и HbA1c каждые три-шесть месяцев для мониторинга прогрессирования, предоставление бесплатного глюкометра, тест-полосок и обучение. Непрерывный глюкометр может предоставляться бесплатно каждые 3–6 месяцев. Кроме того, национальная программа мониторинга ASK the Experts, также финансируемая благотворительным фондом Helmsley Charitable Trust, будет доступна тем семьям, у которых есть местные врачи или детские эндокринологи, которые могут работать в тандеме с командой ASK the Experts в Образовательном центре Барбары Дэвис. мониторинг и поддержка. Если исследования ASK/ASK the Experts больше не финансируются, такое же обучение и поддержка будут предоставляться посредством протоколов этого исследования, включая измерение HbA1c каждые три-шесть месяцев, а также бесплатный глюкометр, тест-полоски для измерения уровня глюкозы и обучение.

Оценка вирусного воздействия: Воздействие вирусов будет оцениваться в продольном направлении у матерей и потомства с использованием анализа Virscan. Для первоначального трехлетнего анализа периода исследования образцы сыворотки во время посещений в каждом триместре беременности и послеродового периода, а также образцы, собранные на 6-м месяце жизни у отобранных младенцев с высоким риском (как описано в плане анализа данных), будут протестированы на инструмент панвирусного серологического надзора Virscan. Эта платформа основана на технологии секвенирования фаговой иммунопреципитации (PhIP-seq), в которой используется библиотека бактериофаз, содержащая полнопротеомные пептиды из вирусов, патогенных для человека. Библиотека Virscan содержит пептиды, представляющие наиболее известные патогенные человеческие вирусы (около 400 видов и штаммов), а также другие антигены, перечисленные в базе данных иммунных эпитопов Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (www.iedb.org). Целью долгосрочного исследования после завершения всех этапов и появления у достаточного числа потомков ИА является проведение исследования «случай-контроль» воздействия вируса на матерей и детей среди тех, у кого развился ИА, в зависимости от возраста и контроля, соответствующего HLA. потомство, у которого не развился IA.

Для проведения серологического скрининга образцы сыворотки смешивают с библиотекой, что позволяет антителам связываться со специфическими эпитопами патогена, отображаемыми на поверхности фага. Затем комплексы бактериофаг-антитело подвергают иммунопреципитации, и участок фаговой ДНК, кодирующий искусственно экспрессированные пептидные антигены, с которыми было связано антитело, секвенируют с помощью NGS, чтобы выявить репертуар противовирусных антител в данном образце сыворотки. Анализ данных для выявления антител против широкого спектра патогенов основан на статистической оценке (значения p) относительного обогащения патоген-специфическими пептидами в образцах сыворотки. Таким образом, полученные данные носят качественный характер и не могут быть напрямую сопоставлены с титрами антител, которые можно получить обычными одноплексными серологическими методами.

Эпигенетические исследования и исследования экспрессии генов: метилирование ДНК будет измеряться в периферической цельной крови матери, а экспрессия генов (РНК) измеряться в образцах РНК цельной крови, собранных во время беременности и после родов, а также в образцах цельной крови и РНК потомства, собранных в раннем возрасте до развитие ИИ. Измерения метилирования ДНК и экспрессии генов будут сравниваться в начальный трехлетний период исследования в пуповинной крови потомков матерей с СД1 (n=86) по сравнению с потомками, у которых отец с СД1, но мать без диабета (N=86). в схеме «случай-контроль», соответствующей возрасту матери и риску HLA. Цель долгосрочного анализа после завершения всех этапов состоит в том, чтобы изучить эпигенетические изменения и экспрессию генов в дизайне исследования «случай-контроль», отбирая случаи ИА среди младенцев, которые постоянно являются положительными в отношении ИА, а также среди контрольной группы, подобранной по возрасту и риску HLA. . Количественное определение метилирования будет проводиться с использованием чипа Infinium HumanMmethylation450K Beadchip («450 K») и чипа Infinium MmethylationEPIC («EPIC»), как описано ранее41. В медицинском кампусе Аншутца Университета Колорадо имеется ультрасовременное учреждение, где запущена Инициатива по бионаучным исследованиям РНК (https://medschool.cuanschutz.edu/rbi). с целью обеспечить «гибкий трубопровод от фундаментальных до клинических исследований РНК в медицинском кампусе Аншутц» путем объединения ресурсов по тестированию РНК и информатике.