Efeito do Treinamento Físico na Expressão de Proteínas no Tecido Muscular Esquelético Após o Exercício na Doença Arterial Periférica

Por que esse problema clínico é importante?

A Doença Arterial Periférica (DAP) é um importante problema de saúde na Austrália, com prevalência de 15% em homens com idade superior a 65 anos. O custo direto de saúde da PAD na Austrália foi de US$ 180 milhões em 1994, dos quais 78% estavam associados a hospitalizações. A DAP também é um marcador de doença cardiovascular avançada (DCV) envolvendo vasos coronários, cerebrais, renais e aórticos; com um risco 2-3 vezes maior de mortalidade relacionada a DCV. Em 2006-2007, 25.813 hospitalizações e 2.163 mortes foram resultado de DAP (Australian Institute of Health and Welfare 2009). O envelhecimento da população australiana e a prevalência de DAP aumentam (Australian Institute of Health and Welfare 2009), o gasto nacional anual com saúde em doenças cardiovasculares provavelmente aumentará, excedendo em muito os 5,4 bilhões de dólares gastos em 2000-01 (Australian Bureau of Statistics 2006 ). O sintoma mais frequente da DAP leve a moderada é a claudicação intermitente (IC), definida como dor induzida pela caminhada e cãibras em uma ou ambas as pernas (mais frequentemente na panturrilha) que é aliviada com o repouso. O tratamento primário e mais eficaz para pessoas com claudicação intermitente concentra-se em melhorar a capacidade de caminhar e o estado funcional.

O que já se sabe sobre o efeito do exercício na claudicação intermitente?

Os efeitos benéficos do treinamento físico como tratamento foram confirmados em vários ensaios clínicos randomizados. A forma ideal de exercício ainda não foi elucidada. Os mecanismos de melhora da claudicação com o exercício são amplamente desconhecidos. Embora o exercício estimule um insulto de isquemia-reperfusão (I-R), o exercício repetitivo pode produzir uma resposta adaptativa a esse insulto de I-R. Outros temas potenciais incluem o efeito do exercício na estimulação ou inibição da angiogênese e/ou síntese de proteína muscular.

Embora a principal causa da CI seja a redução do fluxo sanguíneo para os membros inferiores em relação ao aumento da demanda durante o exercício, a fisiopatologia da CI não é completamente compreendida. Por exemplo, a hemodinâmica do membro não se correlaciona intimamente com a apresentação clínica ou as limitações no desempenho máximo do exercício. As medidas hemodinâmicas da gravidade da DAP, como o índice de pressão arterial sistólica tornozelo-braquial (ITB) e o fluxo sanguíneo por pletismografia de medidor de tensão, são preditores fracos da capacidade de exercício em pacientes com IC.

Estudos transversais indicam que a inflamação está associada à presença, progressão e gravidade da DAP. Isso pode explicar o excesso de mortalidade cardiovascular (pelo menos 50% em 10 anos) observado nesses pacientes. O efeito do exercício na claudicação tem sido mais estudado com marcadores inflamatórios no sangue periférico.

Qual a importância de medir a expressão de proteínas no tecido muscular?

Embora os biomarcadores do sangue periférico ajudem a entender as manifestações sistêmicas da claudicação, eles não refletem o que está acontecendo nos músculos e na microcirculação. A maioria das mudanças na expressão de proteínas são muito sutis para serem detectadas no sangue periférico. A facilidade de aquisição não corresponde à facilidade de interrogação. A gama dinâmica de proteínas no soro torna a análise muito desafiadora porque as proteínas de alta abundância tendem a mascarar aquelas de menor abundância; enquanto um pequeno número de proteínas, incluindo albumina, Beta 2-macroglobulina, transferrina e imunoglobulinas, pode representar mais de 90% das proteínas séricas11.

O complemento proteico de uma célula ou tecido é dinâmico e reflete a idade, o ciclo de vida e as condições a que a célula está sujeita ou um estado de doença específico. É claro que na maioria das doenças, as proteínas são submetidas a numerosas alterações, incluindo modificações pós-traducionais e/ou clivagem proteolítica; igualmente em certas doenças, há alteração da expressão de proteínas. O ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) é a molécula que codifica o projeto químico de uma proteína. No entanto, os microarrays que examinam a expressão diferencial do mRNA não fornecerão informações sobre a modificação pós-traducional, portanto, a única maneira de avaliar o impacto das proteínas é no nível da proteína.

Alguns estudos investigaram a diferença nas características histoquímicas e bioquímicas do músculo esquelético entre pacientes com DAP e indivíduos saudáveis ​​da mesma idade. A maioria dos estudos de biópsia muscular de pacientes com DAP demonstrou alterações na distribuição do tipo de fibra muscular, desnervação e alterações no metabolismo muscular sem conhecimento da expressão de proteínas12, 13, 14. Há evidências consideráveis ​​de que o estado metabólico do músculo esquelético é perturbado em pacientes com DAP em comparação com controles saudáveis ​​da mesma idade. Entre as primeiras observações estava o achado inesperado de que a expressão e a atividade de várias enzimas mitocondriais são aumentadas no músculo esquelético de membros com DAP. Os músculos esqueléticos em pacientes com CI mudam com o exercício, mas as evidências atuais não esclarecem os mecanismos de mudança ou se a mudança é a mesma em todos os pacientes. Já sabemos que alguns pacientes melhoram com o exercício, enquanto outros não. Assim, surge a questão de saber se existe uma biodiversidade na resposta desses pacientes ao exercício.

Armstrong et al estudaram distúrbios na homeostase do cálcio do músculo esquelético e sugeriram que eles podem desempenhar um papel fundamental no desenvolvimento de danos musculares induzidos pelo exercício. Algumas das alterações musculares imediatas após o exercício foram atribuídas à degradação de proteínas iniciada por proteases de cisteína não lisossômicas, como a calpaína. A elevação do cálcio intracelular pós-exercício pode ativar as calpaínas. O tecido muscular expressa três calpaínas distintas, incluindo as bem caracterizadas calpaínas ubíquas - m-calpaína, μ-calpaína e n-calpaína. Wang et al concluíram, em estudos com animais, que os níveis aumentados da protease m-calpaína promovem lesão muscular enquanto a expressão da proteína calpastatina pode exercer uma função protetora para lesão muscular. Isso ainda não foi investigado em estudos humanos. Pode-se supor que os níveis de calpastatina e m-calpaína são importantes para explicar a resposta variável ao exercício em IC e por que alguns pacientes melhoram e outros não.

Há algumas evidências conflitantes sobre o benefício do exercício. Tsai et al descobriram que o efeito normal do treinamento na expressão do gene do transportador de glicose 4 (GLUT4) foi completamente eliminado pela isquemia aguda e crônica no nível pré-translacional. Além disso, a atrofia muscular crônica induzida por isquemia foi mais grave nos ratos treinados do que nos ratos não treinados. Esse resultado sugere que, para indivíduos com condições microvasculares prejudicadas, o treinamento físico pode não ser benéfico na manutenção da massa muscular. Assim, o efeito do treinamento físico em seres humanos com IC (isquemia) ainda não foi elucidado.

Sabemos que todos os indivíduos diferem em sua capacidade de exercício e os pacientes com claudicação intermitente não são diferentes. Pacientes submetidos ao exercício para claudicação intermitente, seriam diferentes em termos de expressão de proteínas devido ao exercício. Por esse motivo, os pacientes agiriam como seus próprios controles por meio de uma biópsia de um músculo não afetado de cada indivíduo.

Um exame de espectroscopia de massa aberta de proteínas no músculo esquelético em exercício daria uma visão sobre a via mecanística do efeito do exercício na claudicação intermitente.

Qual a relação entre expressão proteica e inflamação no exercício com claudicação intermitente?

O modelo clínico de exercício induzindo uma lesão do tipo isquemia-reperfusão foi substanciado por evidências de marcadores de inflamação. Os neutrófilos são as primeiras células a começar a se acumular no tecido no local da lesão, destruindo o tecido necrótico por meio da fagocitose enquanto trabalham em conjunto com macrófagos residentes do próprio tecido muscular. A presença de neutrófilos foi documentada no músculo após vários tipos de exercícios excêntricos. Um estudo que analisou a função dos neutrófilos em claudicantes em exercício mostrou aumento da ativação dos neutrófilos manifestada pelo aumento da expressão do agrupamento de receptores de adesão de neutrófilos do antígeno de diferenciação IIb (CD11b) e degranulação manifestada por um aumento na elastase neutrofílica plasmática. Isso ocorreu imediatamente após o exercício nesses pacientes com claudicação intermitente. Ainda não está claro se isso equivale a uma tendência para prever resultados.

A protease m-Calpain é um fator quimiotático para neutrófilos e pode desempenhar um papel na resposta inflamatória local e sistêmica. Tais adaptações nas respostas inflamatórias celulares foram relatadas anteriormente por Kunimatsu et al. Juntamente com a Calpastatina, essas proteínas podem ser a chave na ligação entre o dano muscular local, o reparo e a indução de uma resposta inflamatória sistêmica.

A modificação química de proteínas pode desempenhar um papel na patogênese de distúrbios que vão desde diabetes até aterosclerose e lesões por isquemia-reperfusão e talvez até o próprio processo de envelhecimento. Os produtos finais de glicosilação avançada (AGEs) são os produtos finais das reações de glicosilação nas quais uma molécula de açúcar se liga a uma proteína ou a uma molécula lipídica sem uma enzima para controlar a reação. A formação e acúmulo de AGEs tem sido implicada na progressão de doenças relacionadas à idade, em particular doenças cardiovasculares. Eles têm uma variedade de efeitos patológicos, incluindo a inibição da dilatação vascular por interferir com o óxido nítrico (fator de relaxamento derivado do endotélio), ligando macrófagos e células endoteliais para induzir a secreção de citocinas inflamatórias e aumentar o estresse oxidativo. Nossa hipótese é que o exercício estimula a captação de glicose pelas células endoteliais aumentando a síntese de AGE's. Resta determinar se o exercício novamente aumenta ou reduz esse processo.

O objetivo deste estudo é examinar biomarcadores inflamatórios, incluindo interleucina-6 (IL-6), elastase de neutrófilos e produtos finais glicados avançados com proteínas conhecidas por influenciar o dano ou reparo tecidual (Calpains e Calpastatin) para determinar o efeito de diferentes formas de exercício sobre este processo, a fim de determinar

1. O exercício é apropriado para todos os pacientes? ou seja

   1. Todos os pacientes respondem com uma resposta pró-inflamatória? e
   2. O exercício produz uma resposta adaptativa a isso em todos os pacientes? ou
   3. O exercício estimula um insulto I-R em alguns pacientes que não é reduzido pelo treinamento físico?
   4. Qual é a resposta local do tecido ao exercício em termos de dano ou reparo tecidual (conforme medido pela análise de proteínas)
2. Qual é a melhor forma de exercício para esses pacientes adequados?

3. Existe uma biodiversidade na resposta dos pacientes ao exercício em termos de

   1. Resposta inflamatória sistêmica (baseada em IL-6, elastase de neutrófilos e AGE's)?
   2. Resposta local (com base na análise de proteínas)?

4. A resposta fisiológica ao exercício nesses pacientes reduz o risco de morbimortalidade relacionada a DCV?

   a. Conforme evidenciado por alterações nos parâmetros de resultado do teste de exercício cardiopulmonar (CPET) e na função endotelial.

5. A função endotelial prejudicada é reversível? a. Conforme medido pela dilatação mediada por fluxo.

O uso combinado de dados de sangue sistêmico e tecido muscular local ajudaria a caracterizar as consequências metabólicas e funcionais das alterações da DAP associadas à idade no músculo esquelético. Também ajudaria a identificar uma via mecanística pela qual o exercício exerce seu efeito sobre o paciente com claudicação intermitente.