A Epidemiologia da Doença de Parkinson na Croácia e a Influência de Fatores Genéticos e Microbiota na Progressão e Resultados do Tratamento da Doença (GiOPARK) (GiOPARK)

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, afetando 2-3% da população geral acima de 65 anos. Existem diferenças significativas na incidência dependendo da localização geográfica, raça e etnia. A causa exata da doença ainda é desconhecida, mas o papel de fatores genéticos e ambientais já foi estabelecido. Certas formas genéticas da doença representam uma pequena porcentagem, por isso acredita-se que os fatores ambientais tenham um impacto mais significativo no desenvolvimento da doença. A incidência de DP é maior em pessoas expostas a quantidades significativas de pesticidas e lesões cerebrais traumáticas, enquanto há uma incidência menor em fumantes e pessoas que consomem quantidades mais significativas de cafeína.

Além disso, a microbiota intestinal e oral é considerada um fator significativo na patogênese da doença, devido ao desequilíbrio floral descoberto em pessoas com DP. Neste ponto, não se sabe se a disbiose da microbiota intestinal precede a doença ou é resultado da comunicação neuronal perturbada do eixo fígado-cérebro. Como não houve um estudo epidemiológico adequado realizado na Croácia até agora, não há conhecimento do número de casos de DP relacionados a fatores genéticos e ambientais, tornando este projeto mais impactante científica e socialmente.

Um evento fisiopatológico específico na DP é a perda de neurônios na substância negra, juntamente com o acúmulo da proteína intracelular α-sinucleína em todo o sistema nervoso central. É importante observar que a DP é assintomática por um período prolongado, pois os sintomas começam a se manifestar apenas quando há perda de mais de 70-80% dos neurônios dopaminérgicos. A disfunção das células gliais, células que geralmente são responsáveis ​​por manter as condições homeostáticas no sistema nervoso central, acompanha a DP. A disfunção leva à neuroinflamação e ativação microglial, fagocitose e destruição de neurônios. Por outro lado, falta uma reação nutritiva e reparadora adequada dos astrócitos, células gliais envolvidas na neuroproteção e reparação de lesões no SNC. Infelizmente, ainda não há um biomarcador específico conhecido para a DP, porém alterações de marcadores neurodegenerativos, nutritivos e imunológicos nesses distúrbios permitem o monitoramento experimental da progressão da doença. Pesquisas recentes propuseram uma ligação entre a microflora intestinal e as células gliais em condições fisiológicas, mas também na patogênese de vários distúrbios neurodegenerativos. Atualmente pensa-se que as primeiras alterações fisiopatológicas ocorrem no interior do sistema nervoso intestinal, que está em contacto direto com a microflora intestinal. Dessa forma, a microbiota intestinal poderia modular a patogênese da DP e contribuir para a variabilidade interindividual da apresentação clínica. Embora um pequeno número de estudos tenha focado nessa parte da patogênese da doença, o real efeito da disbiose da microflora intestinal e oral na patogênese da DP não está estabelecido. Além disso, não há estudos que explorem a relação entre fatores genéticos e ambientais, tornando necessários estudos prospectivos com pacientes com DP de novo para esclarecer os efeitos médios da disbiose na progressão da doença e no resultado do tratamento.

O projeto será concluído em quatro anos, sendo os primeiros 20 meses dedicados à primeira fase (pesquisa genético-epidemiológica), e a totalidade dos 48 meses para a segunda fase do projeto (pesquisa clínica prospectiva) Participantes: O grupo de pesquisa em a primeira fase da pesquisa inclui pacientes com DP em toda a República da Croácia. A população incluiria todos os doentes disponíveis atualmente residentes na Croácia, que são membros ou trabalham com a associação croata de pacientes com DP. A resposta estimada é de 10% da população com DP (500-750 pacientes). Os pacientes preencherão os questionários epidemiológicos e os pacientes com DP familiar serão selecionados. O surgimento esperado da forma hereditária da doença na população com DP é de cerca de 10-15% (50-75). A segunda fase da pesquisa (ensaio clínico prospectivo) inclui dois grupos de sujeitos. O primeiro será composto por pacientes dos Centros Hospitalares Clínicos de Rijeka, que ainda não foram tratados ativamente (medicamentos virgens), enquanto o segundo será composto por controles saudáveis ​​na mesma faixa etária. O número alvo de indivíduos em ambos os grupos é 50. O critério de inclusão para a participação de pacientes virgens de tratamento é um diagnóstico de DP confirmado de acordo com os critérios de diagnóstico clínico da Movement Disorder Society. O grupo controle saudável será composto por participantes da mesma faixa etária com o mesmo estado nutricional (índice de massa corporal), além de residir na mesma área geográfica do grupo teste. Os critérios de exclusão para participação incluem planos de dieta exclusivos, doença intestinal crônica, qualquer distúrbio autoimune, doenças infecciosas agudas, inflamação ativa aguda, histórico do paciente positivo para procedimentos cirúrgicos gastrointestinais significativos e um antibiótico ativo, probiótico, suplemento nutritivo, corticosteroide e drogas imunossupressoras.

A primeira fase - estudo genético-epidemiológico (20 meses): Nos primeiros nove meses, em toda a Croácia, serão recrutados participantes que sejam membros ou trabalhem com a associação croata de pacientes com DP. Ao final do primeiro ano da pesquisa, os participantes terão seus exomas completos sequenciados com a ajuda do sequenciamento de próxima geração (NGS), para encontrar variantes genéticas em pacientes croatas. Ao longo do segundo ano de pesquisa, está prevista a análise e divulgação dos resultados, bem como o aconselhamento em participantes com uma variante familiar confirmada da doença. Para isso, os participantes doarão amostras de sangue para análise genética. O número alvo de sujeitos nesta fase da pesquisa é de 50. Os participantes também serão solicitados a preencher vários formulários de estudo estruturados, que devem fornecer uma estimativa do histórico genético do participante, juntamente com informações sobre seu biorritmo, padrões de sono, dieta, objetivos de vida e estresse geral.

A segunda fase - um estudo clínico prospectivo (48 meses): A seleção dos participantes será realizada ao longo do primeiro ano do estudo clínico. Os seguintes intervalos de tempo são selecionados para visitas de controle: linha de base; 6 meses, 12 meses, 24 meses e 30 meses. A análise e divulgação dos resultados estão previstas nos últimos dois anos de pesquisa. Cada participante do estudo terá seu exoma sequenciado com NGS, com foco principalmente nas partes que têm um impacto conhecido na patogênese da DP. Tanto os pacientes quanto a população controle saudável também terão sua composição de microbiota determinada com NGS, bem como seu estado funcional por meio da análise da composição de ácidos graxos de cadeia curta, conhecidos produtos metabólicos da microbiota. O ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática) será usado para avaliar o estado inflamatório, as funções gliais e a progressão da doença também será determinada por meio de marcadores específicos nas amostras de soro e plasma do participante. A espectroscopia de correlação fluorescente (FCS), mais especificamente, a análise fluorescente de intensidade flutuante de tioflavina T (ThT) (FIFA) será usada para determinar a existência de formas proteicas de conformação patológica e sua relação com o grau da doença e terapia. É por esses métodos que os participantes serão solicitados a fornecer uma amostra de sangue, fezes e saliva. A progressão da doença também será monitorada com ultrassonografia transcraniana B-mod e ressonância magnética cerebral.

O sequenciamento do exoma será realizado na linha de base, enquanto a análise da composição e função da microbiota será realizada na primeira e na última visita de controle. Análise de biomarcadores, análise de conformação de proteínas e métodos neurorradiológicos serão realizados em todos os exames de controle. Desde a primeira visita, os participantes serão solicitados a preencher vários questionários de estudo estruturados, que fornecerão uma estimativa do histórico genético do participante, juntamente com informações sobre seu biorritmo, padrões de sono, dieta, objetivos de vida e estresse geral. Além disso, o estado cognitivo dos participantes será avaliado por meio de testes validados como o Mini-Mental State Examination (MMSE) e o Montreal Cognitive Assessment (MoCA), enquanto os sintomas gerais não motores serão avaliados com o auxílio do Non-Mental State Examination. Questionário de Sintomas Motores (NMSQ) e Escala de Sintomas Não Motores (NMSS). Os pacientes também serão avaliados com a ajuda da UPDRS (escala unificada de classificação da doença de Parkinson), a escala de maior destaque na DP.

O principal objetivo da primeira fase do projeto é determinar quais mutações genéticas são as mais representadas na população croata afetada pela forma familiar de DP. Na segunda fase, o objetivo principal é determinar a influência de fatores genéticos e fatores microbiológicos na progressão da doença, bem como nos resultados do tratamento. Os objetivos específicos desta parte do projeto são determinar quantos pacientes na população geral de pacientes com DP apresentam um distúrbio genético e quais genes têm um papel nesse distúrbio, bem como determinar a composição da microbiota intestinal e oral, tanto no grupo de teste de pacientes e o grupo de controle saudável. Além disso, os objetivos específicos são avaliar os efeitos do tratamento padrão da DP na composição da microbiota, progressão da neurodegeneração e atividade da neuroinflamação no SNC e examinar se existe uma ligação entre a função fisiológica e fisiopatológica da microbiota, usando marcadores de progressão da doença e atividade glial. O último objetivo específico é analisar potenciais formas proteicas de conformação patológica que possam ser utilizadas como biomarcador em estágios iniciais da doença e como biomarcador de progressão da doença.

A primeira fase do estudo fornecerá os primeiros dados epidemiológicos sobre a forma familiar de DP, bem como as mutações mais representadas em pacientes com DP na Croácia. Além disso, o estudo clínico prospectivo contribuirá para esclarecer os efeitos interligados de fatores genéticos e ambientais no surgimento e progressão da doença, bem como seu efeito no resultado do tratamento. A análise da composição da microbiota intestinal e oral determinará se existe uma diferença entre a DP e a população saudável, enquanto o uso do perfil de ácidos graxos de cadeia curta determinará as diferenças metabólicas entre os dois grupos. Analisar os marcadores de homeostase do SNC, inflamação e função neuroglial determinará a progressão da doença e também os correlacionará a fatores genéticos, bem como à função e composição da microbiota. Analisar as formas de conformação patológica da alfa-sinucleína pode levar à descoberta de novos biomarcadores nos estágios iniciais da doença, bem como acompanhar a progressão da doença