双相情感障碍综合分期：将生物标志物纳入各阶段进展 (BOARDING-PASS)

双相情感障碍（BD）是一种高度普遍（约占普通人群的1%）且致残的疾病，其特点为慢性且渐进性病程。 BD的自然史通常包括最初的无症状阶段，随后是前驱期，接着是首次综合征发作（抑郁或躁狂），之后通常在没有完全发作间期恢复的情况下反复发作。 越来越多的证据支持BD的纵向病程与神经进展的活跃过程相关，其特征是进行性的大脑改变和功能损害。 多种临床因素可能影响该疾病的轨迹，包括情感发作次数、精神及医学共病的存在、应激性生活事件的暴露以及精神疾病家族史。 神经影像学研究一致支持BD的神经进展假说，证明随着疾病进展，大脑结构和功能改变逐渐显现。 大规模神经网络层面也发现了异常。 特别是，默认模式网络似乎表现出与情感、额顶叶及注意系统过度连接和连接不足的改变模式，涉及负责高效大规模大脑通信的关键枢纽。 此外，在BD患者的未患病亲属中也发现了结构和功能改变。 研究BD其他生物标志物的研究进一步提供了支持该疾病阶段相关进展的证据，尤其是在脑源性神经营养因子（BDNF）和炎症细胞因子方面。 总体而言，BD临床分期领域的最新进展，连同生物标志物（如基因转录调控、神经营养信号、免疫炎症通路、微生物群）和神经影像学（大规模大脑系统的结构和功能）识别方面的进步，为开发多维分期模型提供了强有力的理论依据。 这样的模型将整合临床和神经生物学数据，从而实现更高的诊断、预后和治疗精确度。

具体目标与实验设计

BOARDING PASS研究有以下目标：

1. 使用Kupka & Hillegers分期模型纵向评估BD在18个月内的临床进展；
2. 研究生物和神经影像学标志物在BD阶段转换中的作用（即基因转录调控、炎症、微生物群、结构和功能神经影像学指标）；
3. 基于临床、生物和神经影像学数据的整合，实施预测性机器学习模型，以提供个体化、数据驱动的BD阶段转换预测。

该研究涉及在四个参与中心中的三个连续招募120名受试者：UO1（米兰Fatebenefratelli-Sacco医院）、UO2（贝加莫Papa Giovanni XXIII医院）和UO3（阿布鲁佐2号地方卫生局，兰恰诺-瓦斯托-基耶蒂）。纳入和排除标准详述如下。

纳入标准：

1. 患有或未患BD的受试者，其临床分期符合Kupka和Hillegers模型定义的范围，即： 阶段0（风险增加：有一级亲属患有BD，无精神症状）；阶段1（有一级亲属患有BD，存在非特异性精神症状或抑郁发作）；阶段2（首次轻/躁狂发作，允许根据DSM-5（APA，2013）诊断为BD I型或II型）；阶段3（反复发作：抑郁、轻/躁狂或混合发作）；阶段4（持续未缓解障碍：慢性抑郁、躁狂或混合发作，包括快速循环）；

2. 男女皆可；
3. 年龄≥18岁且≤70岁；
4. 能够提供有效的书面知情同意。

排除标准：

1. 无法提供有效的书面知情同意；
2. 存在智力障碍；
3. 存在严重的伴随医学状况；

4. 存在当前物质使用障碍。 在提供参与研究的书面知情同意后，入组受试者将接受基线评估（T0），然后进入为期18个月的随访期，包括三个后续时间点：T1（T0后6个月）、T2（T0后12个月）和T3（T0后18个月）。 在T0及每个后续时间点，参与者评估将包括：（i）临床和心理测量评估；仅在T0、T2和T3，（ii）生物标志物评估；以及（iii）脑磁共振成像以获取结构和功能MRI数据。

   临床与心理测量评估

   在基线（T0），将为每位研究参与者收集主要的社会人口学和临床变量，并输入匿名数据库。 这些包括：

   （a）社会人口学数据：年龄、性别、种族、教育水平、婚姻状况和职业状况；（b）临床特征：精神疾病家族史、BD亚型、BD发病年龄及相关应激性生活事件、病程、未治疗病程时长、首次抑郁和轻/躁狂发作年龄、首次及最近情感发作的极性、主要极性、终身情感发作总次数、混合或快速循环特征的存在、当前及既往精神药物治疗、医学及精神共病、物质使用障碍史、终身住院次数和自杀企图。

   这些变量将用于根据Kupka和Hillegers模型（Kupka & Hillegers, 2012）在T0分配临床分期。 在每个后续时间点，将更新社会人口学和临床数据，以重新分配相应分期，并评估临床变量与进展至更晚期疾病阶段概率之间的潜在关联。

   临床评估还将包括以下心理测量量表和问卷的施测：简短智力测验（TIB；Sartori, 1997; Colombo, 2002），施测时间约5分钟；汉密尔顿抑郁评定量表（HDRS-21；Hamilton, 1960; Cassano等，1991），施测时间约20分钟；汉密尔顿焦虑评定量表（HARS；Hamilton, 1959; Cassano等，1991），施测时间约15分钟；蒙哥马利-阿斯伯格抑郁评定量表（MADRS；Montgomery & Åsberg, 1979; Palma等，1999），施测时间约15分钟；杨氏躁狂评定量表（YMRS；Young等，1978; Palma等，1999），施测时间约15分钟；以及整体功能评估（GAF；Hall, 1995; APA, 1996），施测时间约2分钟；遗传研究家庭访谈（FIGS）；药物滥用筛查测试（DAST-10），施测时间估计近5分钟。TWEAK测试完成时间约2分钟。 童年创伤问卷（CTQ），需要5-10分钟，将在基线施测。 Paykel近期生活事件量表，施测约15分钟，将在基线进行；临床医生评定量表（CRS），每个时间点记录近2分钟，旨在评估患者对药物治疗的依从性。

   生物标志物评估：基因转录调控、炎症、微生物群数据

   用于基因表达、炎症和微生物群分析的生物样本将在基线、T2和T3收集。 具体如下：

   1. 未刺激唾液样本——即在静息条件下收集的全唾液，无味觉、咀嚼或药物刺激——将使用棉质口腔拭子（Salivette, Sarstedt, Nümbrecht, Germany）获取，并储存于-20°C直至基因组DNA（gDNA）提取。 外泌体也将从唾液中分离，并使用外泌体RNA分离试剂盒纯化miRNA。

   2. 外周静脉血样本将收集在两个含柠檬酸钠的5毫升真空采血管中。 血清和细胞成分将被分离，总RNA及gDNA将从PBMC中提取。

      在三个招募点（单位1、2和3）收集的所有生物样本将被转移到中心实验室（单位4）进行标准化处理和分析，包括：

      - 脂质组学：分析从唾液衍生化中提取的短链脂肪酸（SCFAs），用于LC-MS/MS分析。

      分子生物学研究：

      - 基因表达分析。 PBMC中mRNA种类的相对丰度将通过实时RT-PCR和数字PCR评估。

      - 血液和唾液细胞中的DNA甲基化：a. 总体DNA甲基化状态将使用简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）方法（SURFseq5000平台的SBS测序）分析；b. 基因特异性DNA甲基化研究将在扩增的亚硫酸氢盐（BS）处理DNA上进行，并使用PyroMark Q48（64）分析甲基化水平。

      - 唾液外泌体miRNA：miRNA组分析及网络分析后选定的miRNA通过实时PCR和数字PCR检测。

      • 转录因子DNA结合。 ALPHAScreenTM检测技术用于验证基因启动子处识别的识别元件是否与不同转录因子结合，以及这种结合是否直接受CpG基序甲基化程度调节。
      • 唾液微生物群组成：通过16S rRNA微生物群测序。

      神经影像学评估

      MRI评估将在T0、T2和T3使用3T扫描仪进行，包括：

      - 结构MRI（sMRI）：将使用SPGR序列（TE = 最小值（全）；翻转角，6°；FOV，250毫米；带宽，31.25；矩阵，256 x 256）采集3D T1加权图像，124个轴向切片，厚度1.3毫米。 皮质表面重建后，将基于Desikan Atlas使用FreeSurfer v7.1.0为68个分区皮质区域计算局部脑回指数。 然后应用折刀偏倚估计程序确定每个个体对组水平协方差结构的贡献，生成68×68的个体间距离矩阵。 随后将使用图分析工具箱分析所得结构协方差网络的拓扑组织。

      - 静息态功能MRI：rs-fMRI图像将使用梯度回波EPI序列采集，36个轴向切片（TE = 30毫秒；TR = 2000毫秒；体素大小：3×3×4毫米³；矩阵大小：64×64；FOV：192×192毫米²）；以交错顺序采集。 每个静息态会话将包括400个体积。 预处理将使用FMRIB软件库（FSL）和自定义MATLAB脚本的组合进行。 流程将包括以下步骤：（1）重新定向到标准空间；（2）检测异常体积，随后对异常时间点进行样条插值；（3）空间和时间预处理，包括运动校正（MCFLIRT）、时间高通滤波和空间平滑（FWHM = 5毫米）；（4）结构图像的脑提取；（5）使用FSL-FNIRT非线性配准到MNI152标准空间。 静态和动态功能连接组将通过计算所采用分区方案中所有脑区对之间的z变换皮尔逊相关系数来估计。 动态连接性将使用滑动窗口方法计算，窗口长度为30 TR，步长为2 TR。 这些步骤将通过MATLAB开发的内部软件实现。 图论度量将通过大脑连接工具箱（MATLAB）计算。

      为最小化神经影像学数据的跨站点变异性，结构和功能MRI采集将在两个成像中心使用协调的协议进行，每个中心配备一台3T扫描仪。 机器学习算法 将开发一个机器学习框架，通过整合收集的临床、生物和神经影像学数据来预测BD的临床阶段转换。 为管理多模态数据的整合，我们将采用稳健的预处理流程，包括数据归一化、异常值检测和处理缺失值的插补方法（如k近邻或多重插补）。 机器学习分析将在研究第6个月开始，并使用MATLAB的统计和机器学习工具箱进行，最初由NeuroMiner软件（http://proniapredictors.eu/neurominer/index.html）支持，这是一个经过验证的用于管理异构数据集的软件平台。 NeuroMiner提供广泛的交叉验证框架、预处理策略、监督学习算法、特征选择工具和外部验证方法。 机器学习方法将基于监督分类器，主要是支持向量机（SVM）和贝叶斯模型。 在初步阶段，分类器将在初步数据集上训练和测试，以在受控环境中比较替代预测模型，并确定性能最佳的算法配置。 随后，将采用特征选择程序从候选特征池中识别最具区分性的变量。 这一步对于增强模型可解释性和防止过拟合至关重要，尤其是在多模态研究中典型的小样本、高维数据集中。 实际上，通过减少输入变量数量，特征选择可最小化噪声、降低模型复杂性并提高机器学习预测的泛化能力。 如果需要（即如果特征空间的维度仍然过高），为进一步减少过拟合和计算负担，可能会应用主成分分析。 SVM分类器将优先考虑，因为其在处理高维、小样本数据方面具有鲁棒性。 此外，将应用类别加权，以便对少数类阶段的错误惩罚更重，减少由组大小不均引入的偏差。 模型性能将使用交叉验证技术（例如留一法或分层k折，取决于数据结构和类别分布）评估，并以敏感性、特异性、F1分数和总体准确率来评价，以考虑潜在的类别不平衡。 模型部署到完整数据集需要预定义的最低目标准确率为90%。 研究地点与组织结构 BOARDING-PASS研究将在四个操作单位（UO）进行，每个单位有明确角色以确保高质量数据采集和标准化临床程序。

      - UO1（米兰Fatebenefratelli-Sacco医院）是协调中心，负责患者招募和基线诊断评估、临床和生物数据的标准化收集。 UO1研究者将在多中心研究网络内提供协调和监督，保持临床医生、研究人员和技术人员之间的有效沟通。

      • UO2（贝加莫Papa Giovanni XXIII医院）负责参与者招募、诊断评估、生物样本收集、结构和静息态MRI数据采集（也代表UO1），以及结构神经影像学分析。
      • UO3（兰恰诺-瓦斯托-基耶蒂2号地方卫生局）将进行参与者招募和评估、数据收集和管理、生物样本收集，以及结构和功能神经影像学数据采集。
      • UO4（泰拉莫大学）作为集中设施，负责生物分析，特别是基因转录调控和微生物群分析。 UO4还负责功能神经影像学数据分析和机器学习算法的实施。