Integrativní staging bipolární poruchy: Začlenění biomarkerů do progrese napříč stádii (BOARDING-PASS)

Důvod Bipolární porucha (BD) je vysoce prevaletní (přibližně 1 % v běžné populaci) a invalidizující stav, charakterizovaný chronickým a progresivním průběhem. Přirozený vývoj BD typicky zahrnuje počáteční asymptomatickou fázi, následovanou prodromálním stadiem a následně nástupem prvního syndromického epizody (depresivní nebo manické), po níž obvykle následují recidivující epizody, často bez úplné mezifázové rekonvalescence. Rostoucí množství důkazů podporuje představu, že longitudinální průběh BD je spojen s aktivním procesem neuroprogrese, charakterizovaným progresivními změnami v mozku a funkčním postižením. Několik klinických faktorů může ovlivnit trajektorii poruchy, včetně počtu afektivních epizod, přítomnosti psychiatrických a somatických komorbidit, expozice stresujícím životním událostem a rodinné anamnézy psychiatrických poruch. Neurozobrazovací studie důsledně podporují neuroprogresivní hypotézu u BD, prokazujíce strukturální a funkční změny v mozku, které se postupně objevují s postupem onemocnění. Abnormality byly popsány také na úrovni rozsáhlých neuronálních sítí. Konkrétně se zdá, že Default Mode Network vykazuje změněné vzorce hyper- a hypokonektivity s afektivními, fronto-parietálními a pozornostními systémy, zahrnující klíčové uzly zodpovědné za efektivní komunikaci v rozsáhlých mozkových systémech. Navíc byly strukturální a funkční změny identifikovány také u nepostižených příbuzných pacientů s BD. Studie zkoumající další biomarkery u BD dále poskytly důkazy podporující stadiově související progresi poruchy, zejména s ohledem na neurotrofický faktor odvozený z mozku (BDNF) a zánětlivé cytokiny. Celkově nedávné pokroky v oblasti klinického stagingu BD, spolu s pokrokem v identifikaci biologických markerů (např. modulace transkripce genů, neurotrofická signalizace, imuno-zánětlivé dráhy, mikrobiota) a neurozobrazování (struktura a funkce rozsáhlých mozkových systémů), poskytují silné odůvodnění pro vývoj multidimenzionálního stagingového modelu. Takový model by integroval klinická a neurobiologická data, umožňující větší diagnostickou, prognostickou a terapeutickou přesnost.

Specifické cíle a experimentální design

Studie BOARDING PASS má následující cíle:

1. longitudinálně hodnotit klinickou progresi BD po dobu 18 měsíců pomocí stagingového modelu Kupka & Hillegers;
2. prozkoumat roli biologických a neurozobrazovacích markerů v přechodech stadií BD (tj. regulace transkripce genů, zánět, mikrobiom, strukturální a funkční neurozobrazovací měření);
3. implementovat prediktivní ML model založený na integraci klinických, biologických a neurozobrazovacích dat, aby poskytl individualizovanou a daty řízenou predikci přechodů stadií BD.

Studie zahrnuje postupný nábor 120 subjektů zařazených ve třech ze čtyř účastnících se center: UO1 (ASST Fatebenefratelli-Sacco, Milán), UO2 (ASST Papa Giovanni XXIII, Bergamo) a UO3 (ASL 2 Abruzzo, Lanciano-Vasto-Chieti). Inkluzní a exkluzní kritéria jsou podrobně uvedena níže.

Inkluzní kritéria:

1. Subjekty postižené a nepostižené BD, jejichž klinické stadium spadá do těch definovaných modelem Kupka a Hillegers, konkrétně:

   stadium 0 (zvýšené riziko: mít příbuzného prvního stupně s BD, při absenci psychiatrických příznaků); stadium 1 (mít příbuzného prvního stupně s BD, za přítomnosti nespecifických psychiatrických příznaků nebo depresivní epizody/ epizod); stadium 2 (první hypo/manická epizoda umožňující diagnózu BD typu I nebo II podle DSM-5; APA, 2013); stadium 3 (recidivující epizoda/ epizody: depresivní, hypo/manická nebo smíšená); stadium 4 (přetrvávající neustupující porucha: chronické depresivní, manické nebo smíšené epizody, včetně rychlé cykličnosti);

2. Jedinci obou pohlaví;
3. Věk ≥ 18 let a ≤ 70 let;
4. Schopnost poskytnout platný písemný informovaný souhlas.

Exkluzní kritéria:

1. Neschopnost poskytnout platný písemný informovaný souhlas;
2. Přítomnost intelektuálního postižení;
3. Přítomnost závažného přidruženého somatického onemocnění;

4. Přítomnost aktuální poruchy užívání návykových látek. Po poskytnutí písemného informovaného souhlasu k účasti podstoupí zařazení subjekty vstupní hodnocení (T0) a poté vstoupí do 18měsíčního sledovacího období sestávajícího ze tří následných časových bodů: T1 (6 měsíců po T0), T2 (12 měsíců po T0) a T3 (18 měsíců po T0). V T0 a v každém následném časovém bodě bude hodnocení účastníka zahrnovat: (i) klinické a psychometrické hodnocení; výhradně v T0, T2 a T3, (ii) hodnocení biologických markerů; a (iii) magnetickou rezonanci mozku pro získání strukturálních a funkčních MRI dat.

   Klinické a psychometrické hodnocení

   Na vstupu (T0) budou pro každého účastníka studie shromážděny hlavní sociodemografické a klinické proměnné a zaneseny do anonymizované databáze. Ty zahrnují:

   (a) sociodemografická data: věk, pohlaví, etnicita, vzdělání, rodinný stav a zaměstnání; (b) klinické charakteristiky: rodinná anamnéza psychiatrických poruch, podtyp BD, věk při nástupu BD a související stresující životní události, délka trvání onemocnění, délka neléčeného onemocnění, věk při první depresivní a hypo/manické epizodě, polarita první a nejnovější afektivní epizody, převažující polarita, celkový celoživotní počet afektivních epizod, přítomnost smíšených nebo rychle cyklujících rysů, současná a předchozí psychofarmakologická léčba, somatické a psychiatrické komorbidity, anamnéza poruchy užívání návykových látek, celoživotní počet hospitalizací a pokusů o sebevraždu.

   Tyto proměnné budou použity k přiřazení klinického stadia v T0 podle modelu Kupka a Hillegers (Kupka & Hillegers, 2012). V každém následném časovém bodě budou sociodemografická a klinická data aktualizována, aby bylo možné znovu přiřadit odpovídající stadium a vyhodnotit potenciální asociace mezi klinickými proměnnými a pravděpodobností progrese do pokročilejších stadií onemocnění.

   Klinické hodnocení dále zahrne administraci následujících psychometrických škál a dotazníků: Test di Intelligenza Breve (TIB; Sartori, 1997; Colombo, 2002), doba administrace přibližně 5 minut; Hamiltonova škála deprese (HDRS-21; Hamilton, 1960; Cassano et al., 1991), doba administrace přibližně 20 minut; Hamiltonova škála úzkosti (HARS; Hamilton, 1959; Cassano et al., 1991), doba administrace přibližně 15 minut; Montgomery-Åsbergova škála deprese (MADRS; Montgomery & Åsberg, 1979; Palma et al., 1999), doba administrace přibližně 15 minut; Youngova manická škála (YMRS; Young et al., 1978; Palma et al., 1999), doba administrace přibližně 15 minut; a Globální hodnocení fungování (GAF; Hall, 1995; APA, 1996), doba administrace přibližně 2 minuty; Family Interview for Genetic Studies (FIGS); Drugs Abuse Screening Test (DAST-10), doba administrace byla odhadnuta na téměř 5 minut. TWEAK test s dobou vyplnění zhruba 2 minuty. Dotazník dětské traumatu (CTQ), vyžaduje 5-10 minut a bude administrován na vstupu. Paykelova škála pro nedávné životní události, její administrace trvá přibližně 15 minut a bude provedena na vstupu; Škála hodnocení klinikem (CRS), zaznamenávána za téměř 2 minuty v každém časovém bodě a zaměřená na hodnocení adherence pacientů k farmakologické léčbě.

   Hodnocení biologických markerů: Regulace transkripce genů, zánět, data mikrobiomu

   Biologické vzorky pro analýzu exprese genů, zánětu a mikrobiomu budou odebrány na vstupu, v T2 a T3. Konkrétně:

   1. nestimulované vzorky slin - tj. celé sliny sebrané v klidových podmínkách bez chuťové, žvýkací nebo farmakologické stimulace - budou získány pomocí bavlněných bukálních stěrů (Salivette, Sarstedt, Nümbrecht, Německo) a skladovány při -20 °C až do extrakce genomické DNA (gDNA). Exozomy budou také izolovány ze slin a miRNA purifikovány pomocí soupravy pro izolaci RNA z exozomů.

   2. periferní venózní vzorky krve budou odebrány do dvou 5 ml zkumavek obsahujících citrát sodný. Sérum a buněčné složky budou odděleny a celková RNA i gDNA budou extrahovány z PBMC.

      Všechny biologické vzorky sebrané na třech náborových pracovištích (Jednotky 1, 2 a 3) budou převezeny do centrální laboratoře (Jednotka 4) pro standardizované zpracování a analýzy, včetně:

      - LIPIDOMIKA pro analýzu mastných kyselin s krátkým řetězcem (SCFAs) extrahovaných ze slin bude provedena derivatizace pro LC-MS/MS analýzu.

      Molekulárně biologické studie:

      - analýza exprese genů. Relativní abundance mRNA druhů v PBMC bude hodnocena pomocí real-time RT-PCR a digitální PCR.

      - metylace DNA v buňkách krve i slin a. obecný stav metylace DNA bude analyzován pomocí metody redukovaného reprezentačního bisulfitového sekvenování (RRBS) (SBS sekvenování platformy SURFseq5000); b. studie genově specifické metylace DNA bude provedena na amplifikované bisulfitem (BS) ošetřené DNA a úrovně metylace analyzovány pomocí PyroMark Q48 (64).

      - slinné exozomální miRNA: analýza miRNOmu a vybraných miRNA po síťové analýze pomocí RealTime PCR a digitální PCR.

      • Vazba transkripčních faktorů na DNA. Technika ALPHAScreenTM assay k ověření, zda identifikované rozpoznávací elementy v promotorech genů vážou různé transkripční faktory a zda je tato vazba přímo modulována stupněm metylace CpG motivů.
      • Složení slinného MIKROBIOMU sekvenováním mikrobiomu 16S rRNA.

      Neurozobrazovací hodnocení

      MRI hodnocení budou provedena pomocí 3T skenerů v T0, T2 a T3 a zahrnují:

      - Strukturální MRI (sMRI): 3D T1-vážené obrazy budou získány pomocí sekvence SPGR (TE = minimum (full); flip angle, 6°; FOV, 250 mm; bandwidth, 31.25; matrix, 256 x 256) s 124 axiálními řezy o tloušťce 1,3 mm. Po rekonstrukci kortikálního povrchu budou vypočteny lokální indexy gyrifikace pro 68 parcelovaných kortikálních oblastí na základě Desikanova atlasu pomocí FreeSurfer v7.1.0. Poté bude aplikován postup odhadu zkreslení jackknife k určení příspěvku každého jednotlivce ke kovarianční struktuře na úrovni skupiny, čímž vznikne 68×68 matice vzdáleností pro jednotlivce. Topologická organizace výsledných strukturálních kovariančních sítí bude následně analyzována pomocí Graph Analysis Toolbox.

      - Funkční MRI v klidovém stavu: rs-fMRI obrazy budou získány pomocí gradient-echo EPI sekvence s 36 axiálními řezy (TE = 30 ms; TR = 2000 ms; velikost voxelu: 3×3×4 mm3; velikost matrix: 64×64; FOV: 192×192 mm2);, pořízeny v prokládaném pořadí. Každá sezení v klidovém stavu bude sestávat z 400 objemů. Předzpracování bude provedeno pomocí kombinace FMRIB's Software Library (FSL) a vlastních skriptů MATLAB. Pipeline bude zahrnovat následující kroky: (1) reorientace do standardního prostoru; (2) detekce odlehlých objemů, následovaná spline-based interpolací odlehlých časových bodů; (3) prostorové a časové předzpracování, včetně korekce pohybu (MCFLIRT), časového high-pass filtru a prostorového vyhlazení (FWHM = 5 mm); (4) extrakce mozku ze strukturálního obrazu; (5) nelineární registrace do standardního prostoru MNI152 pomocí FSL-FNIRT. Statické a dynamické funkční konektomy budou odhadnuty výpočtem z-transformovaných Pearsonových korelačních koeficientů mezi všemi páry mozkových oblastí v přijatém schématu parcelace. Dynamická konektivita bude vypočtena pomocí přístupu klouzavého okna s délkou okna 30 TRs a krokem 2 TRs. Tyto kroky budou implementovány prostřednictvím vlastního softwaru vyvinutého v MATLAB. Grafově-teoretická měření budou vypočtena pomocí Brain Connectivity Toolbox (MATLAB).

      Pro minimalizaci mezilehlé variability v neurozobrazovacích datech budou jak strukturální, tak funkční MRI akvizice prováděny pomocí harmonizovaných protokolů napříč dvěma zobrazovacími centry, z nichž každé je vybaveno 3 T skenerem. ML algoritmy Bude vyvinut ML rámec pro predikci přechodů klinických stadií v BD integrací sebraných klinických, biologických a neurozobrazovacích dat. Pro zvládnutí integrace multimodálních dat přijmeme robustní předzpracovací pipeline včetně normalizace dat, detekce odlehlých hodnot a imputačních metod pro zpracování chybějících hodnot (např. k-nearest neighbor nebo multiple imputation). ML analýzy začnou v 6. měsíci studie a budou prováděny pomocí MATLAB's Statistics and Machine Learning Toolbox, zpočátku podporovány softwarem NeuroMiner (http://proniapredictors.eu/neurominer/index.html), ověřenou softwarovou platformou navrženou pro správu heterogenních datových souborů. NeuroMiner poskytuje širokou škálu cross-validačních rámců, strategií předzpracování, algoritmů supervizovaného učení, nástrojů pro výběr prvků a metod externí validace. ML přístup bude založen na supervizovaných klasifikátorech, primárně Support Vector Machine (SVM) a bayesovských modelech. V předběžné fázi budou klasifikátory trénovány a testovány na předběžných datových souborech, aby byly porovnány alternativní prediktivní modely v kontrolovaném prostředí a identifikována nejlépe fungující algoritmická konfigurace. Následně budou použity postupy výběru prvků k identifikaci nejvíce diskriminačních proměnných z fondu kandidátních prvků. Tento krok je klíčový pro zlepšení interpretovatelnosti modelu a prevenci přetrénování, zejména v malých vzorcích, vysoce dimenzionálních datových souborech typických pro multimodální studie. Ve skutečnosti, snížením počtu vstupních proměnných, výběr prvků minimalizuje šum, snižuje složitost modelu a zlepšuje generalizovatelnost ML predikcí. V případě potřeby (tj. pokud je dimenzionalita prostoru prvků stále příliš vysoká), pro další snížení přetrénování a výpočetní zátěže, může být aplikována Analýza hlavních komponent. SVM klasifikátory budou upřednostněny kvůli jejich robustnosti při zpracování vysoce dimenzionálních dat s malými vzorky. Navíc bude aplikováno vážení tříd tak, aby chyby na menšinových stadiích byly penalizovány více, čímž se sníží zkreslení způsobené nerovnoměrnými velikostmi skupin. Výkon modelu bude hodnocen pomocí cross-validačních technik (např. leave-one-out nebo stratified k-fold, v závislosti na struktuře dat a distribuci tříd) a hodnocen z hlediska senzitivity, specificity, F1 skóre a celkové přesnosti, aby bylo zohledněno potenciální nerovnováhy tříd. Pro nasazení modelu na celý datový soubor je vyžadována předem definovaná minimální cílová přesnost 90 %. Studijní pracoviště a organizační struktura Studie BOARDING-PASS bude prováděna napříč čtyřmi operačními jednotkami (UOs), z nichž každá má definované role pro zajištění vysoce kvalitní akvizice dat a standardizovaných klinických postupů.

      - UO1 (ASST Fatebenefratelli-Sacco, Milán) je koordinační centrum, zodpovědné za nábor pacientů a vstupní diagnostická hodnocení, standardizovaný sběr klinických a biologických dat. Výzkumníci UO1 zajistí koordinaci a dohled v rámci multicentrické výzkumné sítě, udržujíce efektivní komunikaci mezi kliniky, výzkumníky a technickým personálem.

      • UO2 (ASST Papa Giovanni XXIII, Bergamo) je zodpovědná za nábor účastníků, diagnostické hodnocení, sběr biologických vzorků, akvizici strukturálních a resting-state MRI dat také jménem UO1 a analýzu strukturálního neurozobrazování.
      • UO3 (ASL 2 Lanciano-Vasto-Chieti) provede nábor a hodnocení účastníků, sběr a správu dat, sběr biologických vzorků, stejně jako akvizici strukturálních a funkčních neurozobrazovacích dat.
      • UO4 (University of Teramo) slouží jako centralizované zařízení zodpovědné za biologické analýzy, konkrétně regulaci transkripce genů a analýzy mikrobiomu. UO4 je také zodpovědná za analýzu funkčních neurozobrazovacích dat a za implementaci ML algoritmů.