Estadiamento Integrativo do Transtorno Bipolar: Incorporando Biomarcadores na Progressão ao Longo dos Estágios (BOARDING-PASS)

Fundamentação A Perturbação Bipolar (PB) é uma condição altamente prevalente (aproximadamente 1% na população geral) e incapacitante, caracterizada por um curso crónico e progressivo. A história natural da PB tipicamente inclui uma fase inicial assintomática, seguida por um estádio prodrómico, e posteriormente o início de um primeiro episódio sindrómico (depressivo ou maníaco), que é geralmente seguido por episódios recorrentes, frequentemente na ausência de recuperação interepisódica completa. Um corpo crescente de evidências apoia a noção de que o curso longitudinal da PB está associado a um processo ativo de neuroprogressão, caracterizado por alterações cerebrais progressivas e comprometimento funcional. Vários fatores clínicos podem influenciar a trajetória da perturbação, incluindo o número de episódios afetivos, a presença de comorbilidades psiquiátricas e médicas, exposição a eventos de vida stressantes e história familiar de perturbações psiquiátricas. Estudos de neuroimagem têm consistentemente apoiado a hipótese neuroprogressiva na PB, demonstrando alterações cerebrais estruturais e funcionais que emergem progressivamente à medida que a doença avança. Anomalias também foram descritas ao nível das redes neuronais de larga escala. Em particular, a Rede de Modo Predefinido parece exibir padrões alterados de hiper e hipoconexividade com sistemas afetivos, fronto-parietais e atencionais, envolvendo hubs-chave responsáveis pela comunicação cerebral eficiente em larga escala. Além disso, alterações estruturais e funcionais também foram identificadas em familiares não afetados de doentes com PB. Estudos que investigam biomarcadores adicionais na PB forneceram ainda mais evidências que apoiam uma progressão relacionada com o estádio da perturbação, particularmente no que diz respeito ao Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) e citocinas inflamatórias. No geral, os avanços recentes no campo da estadiagem clínica da PB, juntamente com o progresso na identificação de marcadores biológicos (por exemplo, modulação da transcrição génica, sinalização neurotrófica, vias imuno-inflamatórias, microbiota) e neuroimagem (estrutura e função de sistemas cerebrais de larga escala), fornecem uma forte fundamentação para o desenvolvimento de um modelo de estadiagem multidimensional. Tal modelo integraria dados clínicos e neurobiológicos, permitindo uma maior precisão diagnóstica, prognóstica e terapêutica.

Objetivos específicos e desenho experimental

O estudo BOARDING PASS tem os seguintes objetivos:

1. avaliar longitudinalmente a progressão clínica da PB durante um período de 18 meses utilizando o modelo de estadiagem de Kupka & Hillegers;
2. investigar o papel de marcadores biológicos e de neuroimagem nas transições de estádio da PB (ou seja, regulação da transcrição génica, inflamação, medidas microbióticas, de neuroimagem estrutural e funcional);
3. implementar um modelo preditivo de ML baseado na integração de dados clínicos, biológicos e de neuroimagem, de forma a fornecer uma previsão individualizada e baseada em dados das transições de estádio da PB.

O estudo envolve o recrutamento consecutivo de 120 sujeitos inscritos em três dos quatro centros participantes: UO1 (ASST Fatebenefratelli-Sacco, Milão), UO2 (ASST Papa Giovanni XXIII, Bérgamo) e UO3 (ASL 2 Abruzzo, Lanciano-Vasto-Chieti). Os critérios de inclusão e exclusão estão detalhados abaixo.

Critérios de Inclusão:

1. Sujeitos afetados e não afetados por PB cujo estádio clínico se enquadra naqueles definidos pelo modelo de Kupka e Hillegers, nomeadamente:

   estádio 0 (risco aumentado: ter um familiar de primeiro grau com PB, na ausência de sintomas psiquiátricos); estádio 1 (ter um familiar de primeiro grau com PB, na presença de sintomas psiquiátricos inespecíficos ou episódio(s) depressivo(s)); estádio 2 (primeiro episódio hipo/maníaco que permita um diagnóstico de PB tipo I ou II de acordo com o DSM-5; APA, 2013); estádio 3 (episódio(s) recorrente(s): depressivo, hipo/maníaco ou misto); estádio 4 (perturbação persistente não remitente: episódios depressivos, maníacos ou mistos crónicos, incluindo ciclagem rápida);

2. Indivíduos de ambos os sexos;
3. Idade ≥ 18 anos e ≤ 70 anos;
4. Capacidade para fornecer consentimento informado escrito válido.

Critérios de Exclusão:

1. Incapacidade para fornecer consentimento informado escrito válido;
2. Presença de deficiência intelectual;
3. Presença de uma condição médica concomitante grave;

4. Presença de uma perturbação por uso de substâncias atual.

   Após fornecer consentimento informado escrito para participar, os sujeitos inscritos serão submetidos a uma avaliação basal (T0) e entrarão depois num período de seguimento de 18 meses composto por três pontos temporais subsequentes: T1 (6 meses após T0), T2 (12 meses após T0) e T3 (18 meses após T0).

   Em T0 e em cada ponto temporal subsequente, a avaliação do participante incluirá: (i) avaliação clínica e psicométrica; exclusivamente em T0, T2 e T3, (ii) avaliação de marcadores biológicos; e (iii) ressonância magnética cerebral para aquisição de dados de RM estrutural e funcional.

   Avaliação Clínica e Psicométrica

   Na linha de base (T0), para cada participante do estudo, as principais variáveis sociodemográficas e clínicas serão recolhidas e introduzidas numa base de dados anonimizada. Estas incluem:

   (a) dados sociodemográficos: idade, sexo, etnia, nível de escolaridade, estado civil e situação profissional; (b) características clínicas: história familiar de perturbações psiquiátricas, subtipo de PB, idade de início da PB e eventos de vida stressantes associados, duração da doença, duração da doença não tratada, idade no primeiro episódio depressivo e hipo/maníaco, polaridade do primeiro e do mais recente episódio afetivo, polaridade predominante, número total de episódios afetivos ao longo da vida, presença de características mistas ou de ciclagem rápida, tratamentos psicofarmacológicos atuais e anteriores, comorbilidades médicas e psiquiátricas, história de perturbação por uso de substâncias, número de hospitalizações ao longo da vida e tentativas de suicídio.

   Estas variáveis serão utilizadas para atribuir o estádio clínico em T0 de acordo com o modelo de Kupka e Hillegers (Kupka & Hillegers, 2012). Em cada ponto temporal subsequente, os dados sociodemográficos e clínicos serão atualizados de forma a reatribuir o estádio correspondente e avaliar potenciais associações entre variáveis clínicas e a probabilidade de progressão para estádios mais avançados da doença.

   A avaliação clínica incluirá ainda a administração das seguintes escalas e questionários psicométricos: o Teste de Inteligência Breve (TIB; Sartori, 1997; Colombo, 2002), tempo de administração aproximadamente 5 minutos; a Escala de Avaliação da Depressão de Hamilton (HDRS-21; Hamilton, 1960; Cassano et al., 1991), tempo de administração aproximadamente 20 minutos; a Escala de Avaliação da Ansiedade de Hamilton (HARS; Hamilton, 1959; Cassano et al., 1991), tempo de administração aproximadamente 15 minutos; a Escala de Avaliação da Depressão de Montgomery-Åsberg (MADRS; Montgomery & Åsberg, 1979; Palma et al., 1999), tempo de administração aproximadamente 15 minutos; a Escala de Avaliação da Mania de Young (YMRS; Young et al., 1978; Palma et al., 1999), tempo de administração aproximadamente 15 minutos; e a Avaliação Global do Funcionamento (GAF; Hall, 1995; APA, 1996), tempo de administração aproximadamente 2 minutos; Entrevista Familiar para Estudos Genéticos (FIGS); Teste de Triagem de Abuso de Drogas (DAST-10), o tempo de administração foi estimado em cerca de 5 minutos. Teste TWEAK com um tempo de conclusão de aproximadamente 2 minutos. Questionário de Trauma na Infância (CTQ), requer 5-10 minutos e será administrado na linha de base. Escala de Paykel para Eventos de Vida Recentes, a sua administração demora aproximadamente 15 minutos e será realizada na linha de base; Escala de Avaliação do Clínico (CRS), registada em cerca de 2 minutos em cada ponto temporal e destinada a avaliar a adesão dos doentes ao tratamento farmacológico.

   Avaliação de marcadores biológicos: Regulação da transcrição génica, inflamação, dados do microbioma

   Amostras biológicas para análises de expressão génica, inflamação e microbioma serão recolhidas na linha de base, T2 e T3. Especificamente:

   1. amostras de saliva não estimulada - ou seja, saliva total recolhida em condições de repouso sem estimulação gustativa, mastigatória ou farmacológica - serão obtidas utilizando zaragatoas bucais de algodão (Salivette, Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha) e armazenadas a -20 °C até à extração de DNA genómico (gDNA). Exossomas também serão isolados da saliva e miRNAs purificados utilizando um kit de isolamento de RNA de exossomas.

   2. amostras de sangue venoso periférico serão recolhidas em dois tubos vacutainer de 5 ml contendo citrato de sódio. O soro e os componentes celulares serão separados e o RNA total, bem como o gDNA, serão extraídos de PBMCs.

      Todas as amostras biológicas recolhidas nos três locais de recrutamento (Unidades 1, 2 e 3) serão transferidas para o laboratório central (Unidade 4) para processamento e análises padronizadas, incluindo:

      - LIPIDÓMICA para analisar ácidos gordos de cadeia curta (SCFAs) extraídos da saliva, será realizada a derivação para análise por LC-MS/MS.

      Estudos de biologia molecular:

      - análise de expressão génica. A abundância relativa de espécies de mRNA em PBMCs será avaliada por RT-PCR em tempo real e PCR Digital.

      - metilação do DNA tanto em células sanguíneas como salivares a. o estado geral de metilação do DNA será analisado utilizando o método de sequenciação de bisulfito de representação reduzida (RRBS) (sequenciação SBS da plataforma SURFseq5000); b. o estudo de metilação do DNA específico do gene será realizado em DNA tratado com bisulfito (BS) amplificado e os níveis de metilação analisados utilizando PyroMark Q48 (64).

      - miRNAs exossomais salivares: análise do miRNOme e miRNAs selecionados após análise de rede por PCR em Tempo Real e PCR Digital.

      • Ligação de DNA de fatores transcricionais. Técnica de ensaio ALPHAScreenTM para verificar se elementos de reconhecimento identificados no promotor de genes se ligam a diferentes fatores transcricionais e se esta ligação é diretamente modulada pelo grau de metilação de motivos CpG.
      • COMPOSIÇÃO DO MICROBIOTA SALIVAR por sequenciação do Microbioma do rRNA 16S.

      Avaliação de Neuroimagem

      As avaliações de RM serão realizadas utilizando scanners de 3T em T0, T2 e T3, e compreendem:

      - RM estrutural (sMRI): imagens ponderadas em T1 3D serão adquiridas utilizando uma sequência SPGR (TE = mínimo (completo); ângulo de flip, 6°; FOV, 250 mm; largura de banda, 31,25; matriz, 256 x 256) com 124 fatias axiais de 1,3 mm de espessura. Após a reconstrução da superfície cortical, os índices de gireificação local serão calculados para 68 regiões corticais parceladas com base no Atlas de Desikan utilizando o FreeSurfer v7.1.0. Um procedimento de estimativa de viés jackknife será então aplicado para determinar a contribuição de cada indivíduo para a estrutura de covariância ao nível do grupo, gerando uma matriz de distâncias individual de 68×68. A organização topológica das redes de covariância estrutural resultantes será subsequentemente analisada utilizando a Graph Analysis Toolbox.

      - RM funcional em estado de repouso: imagens de rs-fMRI serão adquiridas utilizando uma sequência EPI de eco de gradiente com 36 fatias axiais (TE = 30 ms; TR = 2000 ms; tamanho do voxel: 3×3×4 mm3; tamanho da matriz: 64×64; FOV: 192×192 mm2);, adquiridas em ordem intercalada. Cada sessão de estado de repouso consistirá em 400 volumes. O pré-processamento será conduzido utilizando uma combinação da FMRIB's Software Library (FSL) e scripts personalizados em MATLAB. O pipeline incluirá os seguintes passos: (1) reorientação para o espaço padrão; (2) deteção de volumes outliers, seguida de interpolação baseada em spline dos pontos temporais outliers; (3) pré-processamento espacial e temporal, incluindo correção de movimento (MCFLIRT), filtragem passa-alta temporal e suavização espacial (FWHM = 5 mm); (4) extração cerebral da imagem estrutural; (5) registo não linear para o espaço padrão MNI152 utilizando FSL-FNIRT. Os conectomas funcionais estáticos e dinâmicos serão estimados calculando coeficientes de correlação de Pearson transformados em z entre todos os pares de regiões cerebrais no esquema de parcelamento adotado. A conectividade dinâmica será computada utilizando uma abordagem de janela deslizante com um comprimento de janela de 30 TRs e um tamanho de passo de 2 TRs. Estes passos serão implementados através de software interno desenvolvido em MATLAB. Medidas de teoria dos grafos serão computadas através da Brain Connectivity Toolbox (MATLAB).

      Para minimizar a variabilidade interlocal nos dados de neuroimagem, tanto as aquisições de RM estrutural como funcional serão realizadas utilizando protocolos harmonizados nos dois centros de imagem, cada um equipado com um scanner de 3 T.

      Algoritmos de ML Um framework de ML será desenvolvido para prever transições de estádio clínico na PB através da integração de dados clínicos, biológicos e de neuroimagem recolhidos. Para gerir a integração de dados multimodais, adotaremos pipelines de pré-processamento robustos incluindo normalização de dados, deteção de outliers e métodos de imputação para lidar com valores em falta (por exemplo, k-vizinho mais próximo ou imputação múltipla). As análises de ML começarão no mês 6 do estudo e serão conduzidas utilizando a Statistics and Machine Learning Toolbox do MATLAB, inicialmente suportadas pelo software NeuroMiner (http://proniapredictors.eu/neurominer/index.html), uma plataforma de software validada concebida para gerir conjuntos de dados heterogéneos. O NeuroMiner fornece uma ampla gama de frameworks de validação cruzada, estratégias de pré-processamento, algoritmos de aprendizagem supervisionada, ferramentas de seleção de características e métodos de validação externa. A abordagem de ML será baseada em classificadores supervisionados, principalmente Máquina de Vetores de Suporte (SVM) e modelos Bayesianos. Na fase preliminar, os classificadores serão treinados e testados em conjuntos de dados preliminares para comparar modelos preditivos alternativos num ambiente controlado e identificar a configuração algorítmica de melhor desempenho. Subsequentemente, procedimentos de seleção de características serão empregues para identificar as variáveis mais discriminativas do conjunto de características candidatas. Este passo é crucial para melhorar a interpretabilidade do modelo e prevenir o sobreajuste, especialmente em conjuntos de dados de pequena amostra e alta dimensionalidade típicos de estudos multimodais. De facto, ao reduzir o número de variáveis de entrada, a seleção de características minimiza o ruído, reduz a complexidade do modelo e melhora a generalizabilidade das previsões de ML. Se necessário (ou seja, se a dimensionalidade do espaço de características ainda for demasiado alta), para reduzir ainda mais o sobreajuste e a carga computacional, poderá ser aplicada a Análise de Componentes Principais. Os classificadores SVM serão priorizados devido à sua robustez no manuseio de dados de alta dimensionalidade e pequena amostra. Além disso, será aplicada ponderação de classe para que erros em estádios minoritários sejam penalizados mais fortemente, reduzindo o viés introduzido por tamanhos de grupo desiguais. O desempenho do modelo será avaliado utilizando técnicas de validação cruzada (por exemplo, leave-one-out ou k-fold estratificado, dependendo da estrutura dos dados e distribuição de classes) e avaliado em termos de sensibilidade, especificidade, pontuação F1 e precisão geral, de forma a ter em conta o potencial desequilíbrio de classes. Uma precisão mínima alvo pré-definida de 90% é necessária para a implementação do modelo no conjunto de dados completo.

      Locais do estudo e estrutura organizacional O estudo BOARDING-PASS será conduzido em quatro unidades operacionais (UOs), cada uma com funções definidas para garantir a aquisição de dados de alta qualidade e procedimentos clínicos padronizados.

      - UO1 (ASST Fatebenefratelli-Sacco, Milão) é o centro coordenador, responsável pelo recrutamento de doentes e avaliações diagnósticas basais, recolha padronizada de dados clínicos e biológicos. Os investigadores da UO1 fornecerão coordenação e supervisão dentro da rede de investigação multicêntrica, mantendo comunicação eficaz entre clínicos, investigadores e pessoal técnico.

      • UO2 (ASST Papa Giovanni XXIII, Bérgamo) é responsável pelo recrutamento de participantes, avaliação diagnóstica, recolha de amostras biológicas, aquisição de dados de RM estrutural e em estado de repouso também em nome da UO1, e análise de neuroimagem estrutural.
      • UO3 (ASL 2 Lanciano-Vasto-Chieti) conduzirá o recrutamento e avaliação de participantes, recolha e gestão de dados, recolha de amostras biológicas, bem como aquisição de dados de neuroimagem estrutural e funcional.
      • UO4 (Universidade de Teramo) serve como instalação centralizada responsável pelas análises biológicas, especificamente regulação da transcrição génica e análises de microbiota. A UO4 é também responsável pela análise de dados de neuroimagem funcional e pela implementação de algoritmos de ML.